A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam.

Az előadások a következő témára: "A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam."— Előadás másolata:

1 A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam A légúti infekciók klinikuma és diagnosztikai kérdései 2013 szeptember 09.

2

3 Nemzeti Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium

4 Referencia Laboratórium működése Corden/Korányi
2009-ben felújított, korszerű, európai szintű BSL-2-3 szintnek megfelelő helyiségek a veszélyességi fokozatnak megfelelő munkafolyamatok szerint Légtechnika, falhűtés, zsilip rendszer, negatív nyomás, lamináris bokszok, zárt rotorú centrifugák Modern, korszerű technikai eszközök GeneXpert NorDiag Arrow Wescor HAIN A laboratórium jelenlegi diagnosztikai palettája, felszereltsége korszerű, nem marad el a fejlett európai országok ref. laboratóriumaitól (WHO : Mission report)

5

6 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TÖRTÉNETE
Koch Róbert: gümőbaktérium felfedezése, 1882 Nobel-díj, 1905 Ehrlich: saválló festés Franz Ziehl és Friedrich Neelsen: saválló festés továbbfejlesztése Koch Róbert

7 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TULAJDONSÁGAI
Morfológiai sajátságok: 0,2-0,5µm átm. 1,0-5 µm hosszú, tokkal, spórával, csillóval nem rendelkező baktérium Gram szerint nem festhető Sav-és alkohol álló (carbolfuxin) Sejtfal lipidekben gazdag, hidrofób mycolsav tartalmú Ellenálló: hónapokig életképes Cord formáció: virulencia faktor 7

8 MYCOBACTERIUM NEMZETSÉG (>150 species)
Előfordulás: talaj, természetes vizek, hálózati meleg víz Pathogenitás: OBLIGÁT OPPORTUNISTA SAPROPHYTA M. tuberculosis complex NTM M. tuberculosis M. avium M. gordonae M. bovis, M.caprae M. simiae M. terrae M. bovis BCG M. xenopi M. triviale M. africanum M. srophulaceum M. phlei M. microti M. fortuitum M. vaccae M. canetti M. chelonae M. nonchromog. M. pinnipedii M. kansasii M. flavescens

9 Pathogenitás Species Rezervoár Betegség
Pathogen M.tuberculosis ember, vadak, M.bovis, M.caprae szarvasmarha M.tub complex M.bovis BCG, vaddisznó, borz tbc M.africanum, M.microti M.canetti, M.pinnipedii fóka M.leprae M.leprae lepra Potenciálisan M.avium talaj, madár, víz disszeminált-és pathogen M.intracellulare sertés, szarvasmarha tüdő inf. (AIDS) M.kansasii víz, szarvasmarha tüdő inf. M.marinum halak, víz bőrfekélyek M.ulcerans ember, környezet fekélyek M.abscessus talaj, víz, állat tüdő, tályog, CF M.chelonae disszeminált

10 Fertőzés kialakulásának valószínűsége
Inhaláció (1-5m átmérő) cseppinfekció Nincs fertőzés 70-90% Fertőzés az alveoláris térben 10-30% Látens (nyirokrendszerben) 90% Acut TB (2 éven belül) 5-10% Infekció fellángolása -Endogén reaktiváció -Exogén reinfekció Megbetegedés Az élet során 10% Egy éven belül (HIV) 10% Egy beteg személy másikat képes megfertőzni egy év alatt.

11

12 WHO epidemiológiai adatok
A WHO a tuberculosist húsz évvel ezelőtt világméretű fenyegetésnek nyilvánította A világ népességének 1/3-a gümőbaktériummal fertőzött 8 millió új megbetegedés fordul elő évente 1,5 millió/év mortalitás, malária után a legmagasabb érték A fejlődő országokban (esetek 95 %-a) a felnőttek 20 %-a TBC-ben hal meg HIV/AIDS-ben a TBC a vezető halálok

13 22 high-burden countries totaling 80% of world cases
Russia Cambodia China Philippines Vietnam Afghanistan Pakistan Ethiopia DR Congo Kenya Mozambique Nigeria S. Africa Tanzania Uganda Zimbabwe Bangladesh India Indonesia Myanmar Thailand Brazil Global Tuberculosis Control. WHO Report WHO/CDS/TB/

14 TB burden, EUR 14

15 Az európai TBC járvány változásának okai
1974 – 1990 között az incidencia 5,4 %/év csökkent Európában A trend megfordulásának okai: HIV pandémia Immigráció növekedése K-Európai országokban az Egészségügy szétrombolása Szegénység miatt marginalizálódott populáció növekedése

16 Trend of TB incidence in Hungary
5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 1951 1956 1961 1966 1971 1976 1981 1986 1991 1996 2001 2010 Cases

17 A hazai tuberkulózis járványhelyzet
Megbetegedések száma évről évre csökken: incidencia:1169 fő, 11 %ooo/2012 (2010-ben már eliminációs szak) Rezisztens izolátumok száma „magas” MDR, XDR (hot spot) Nő a NTM okozta mycobacteriosisok száma (5 év alatt megduplázódott) diagnosztika fejlődése

18 LABORATÓRIUMI KIMUTATÁS
1. Direkt mikroszkópos: Ziehl-Neelsen Fluorochrome (auramin, rodamin) 2. Tenyésztés: Szilárd alapú Folyékony alapú Identifikálás: hagyományos és mol. biol. módszerrel Rezisztencia meghatározás: proporciós és mol. biol. módszerrel Molekuláris biológiai módszerek: Direkt kimutatás: TMA, SDA, LCR, HAIN, GeneXpert, ProbeTec Identifikálás: Reverz hibridizáció, DNS szekvenálás, MaldiTof Rezisztencia meghatározás: LineProbe Assay-k:InnoLipa, HAIN Genotipizálás: DNS fingerprint RFLP, Spoligotyping, VNTR-MIRU

19 1. Direkt mikroszkópos vizsgálat
Ziehl-Neelsen: carbolfuchs Kenet készíthető: direkt a mintából Auramin előkezelt minta üledékéből Rodamin fluorochrom cytocentrifugált mintából Előnye: gyors (fontos közegészségügyi szempont) olcsó egyszerű kevés eszköz igény relatíve specifikus (97 % M.TBC) egyéb savállók: atipusos Mycobakterium Rhodococcus Nocardia, Gordona, Tsukamurella, Legionella micdadei Hátránya: alacsony kimutathatósági határ ( CFU/ml)

20

21 Ziehl-Neelsen pozitív pálcák

22 Saválló pálcák

23 Auramin festés

24 Gold standard 2. Tenyésztés Előnye: specifikus
érzékeny: bakt/ml ( %) identifikálni lehet rezisztencia végezhető genotipizálás, epidemiológiai kapcsolatok Hátránya: hosszú tenyésztési idő (6 - 8 hét) (generációs idő: óra) A molekuláris biológiai vizsgálatok mellett is kötelezően elvégzendő!!!

25 2. Tenyésztés Szilárd Folyékony - tojás (L J, Ogawa, Stonebrink)
- agar (7H10, 7H11) % szenz. - 3-8 hét Folyékony - Bactec 12B, MGIT, MB Redox, ESP II, MB/BacT % szenz. nap - több NTM, automatizált

26 M. tuberculosis L-J táptalajon

27 Molekuláris biológiai
IDENTIFIKÁLÁS Hagyományos Növekedés sebessége Növekedés hőfoka Pigment termelés Biokémiai módszerek Molekuláris biológiai Accuprobe RFLP DNS sequenálás DNS chip LineProbe assay-k: HAIN, InnoLipa Maldi-Tof Obligát M.tbc compl. nem pigmentált cord képző niacin + nitrát + Opportunista, szaprofita, NTM pigment lehet cordot ritkán képez niacin – biokémiai próbák növekedés hőfoka és sebessége

28 Cord formáció

29 Mycobakterium kimutatása direkt a mintából Nukleinsav amplifikációs technikák (NAT)
Specifikus nukleinsav szakasz amplifikálása - detektálása • gyors • érzékeny ? (határ: 10 bacillus) •specifikus Fals poz.:• szennyeződés (amplikonok) •élettelen baktériumok is kimutathatók Fals neg.:• minta mennyisége kevés • DNS felszabadítása és lizise nem teljes • a mintában a bakt. eloszlása inhomogén, összecsapzódhatnak Direktben poz. minta Direktben neg. minta szenzitivitás % % specificitás % %

30 Molekuláris biológiai módszerek
Csak légúti anyagokra vannak validálva a tesztek. Extrapulmonális anyagokkal, kezelés alatt álló betegek mintáival kevés a tapasztalat. Élő és élettelen bakt. kimutatható, ezért terápia monitorozására nem alkalmas NAT nem alkalmazható egymagában a M.TBC kimutatására, nem helyettesítheti a tenyésztést, és csak felkészült laboratóriumokban ajánlott az alkalmazásuk Gyorsaságuk miatt azonban differenciál diagnosztikailag problémás esetek kapcsán fontos és hasznos kiegészítő vizsgálatok.

31 MYCOBACTERIUMOK OKOZTA INFEKCIÓK DIAGNOSZTIKAI SÉMÁJA
Pulmonális tbc gyanúja esetén legalább 3 egymást követő napon levett köpetminta bronchoscóppal vett minta, gyomormosó Extrapulmonális kórképek esetén megfelelő mennyiségű releváns vizsgálati anyag A minta előkezelése (koncentrálás, emésztés, dekontaminálás) NALC- NaOH, vagy más módszer Direkt kenet vizsgálata Ziehl-Neelsen, vagy fluorochrom festéssel Tenyésztés Molekuláris biológiai m. (PCR,LCR,TMA, egyéb) Pozitív: előzetes lelet Negatív Eredményt össze kell vetni a tenyésztés és a kenet eredményével Szilárd táptalajon: L J, és vagy agar alapú Folyékony talajon (MGIT,BACTEC) Pozitív: identifikálás, rezisztencia meghatározás Pozitív: Kenet, tenyésztés L J táptalajon

32 Resistencia mechanizmusok
Csökkent sejtfal permeabilitás Enzim termelés (ß-lactamase Aktív pumpa rendszer Génen kialakuló pontmutáció, deleció, inzerció: lépésről lépésre alakul ki, nem blockszerűen (Egyszerre többféle spontán módon létrejövő mutáció ritka, mivel egyszerre több génen kéne mutációnak kialakulni. MDR: halmozódó mutációk sorozata, amely nem spontán alakul ki, hanem emberi beavatkozás következménye Helytelen kezelés Nem megfelelő compliance

33 REZISZTENCIA VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI
Hagyományos Proporciós Molekuláris DNS strip Kritikus koncentrációnál az érzékeny és rezisztens törzsek aránya Rezisztenciáért felelős géneken történt mutációk, deléciók és inserciók detektálása Szilárd alapú: LJ, 7H10 Folyadék alapú: MGIT, Bact/Alert, Bactec460 Line probe assay-k GenoType MTBDR, MTBDR plus InnoLipa Rif.

34 REZISZTENCIA MEGHATÁROZÁS
Minden újonnan izolált törzsből Ellenőrzésként legalább 4-6 havonta (CLSI) Minden rezisztens eredményt megerősíteni Proporciós visgálat/ rezisztencia arány/ Szilárd táptalajon 4-5 hét (biomassza!) Folyékony MGIT 4-5 nap Rezisztenciához társuló mutációk kimutatása RMP (rpoB), INH (katG, inhA) Direkt a mintából Izolált törzsből

35 RMP REZISZTENCIA ÉS MDR TUBERKULÓZIS
A RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia az esetek 70%-ban INH rezisztenciával párosul (= MDR TB) A RMP rezisztencia közel 100%-ban az RNS polimeráz b alegységét kódoló rpoB gén egy igen rövid (81 bp) szakaszán található mutációkkal párosul (Telenti et al., 1993) Így a RMP rezisztenciát okozó mutációk gyors molekuláris detektálása a MDR TB felismeresét is jelentősen meggyorsítja és megkönnyíti

36 GenoType Mycobacteria HAIN
MDR kimutatható Rifampicin rezisztencia rpoB génmutáció INH rezisztencia magas fokú: katG gén alacsony fokú: inhA gén Izolált törzsből Saválló pozitív beteg mintájából közvetlenül

37 for the use of molecular line probe assays
2008 : WHO recommendations for the use of molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of MDR-TB 3) Hybridization Reverse hybridization of amplified nucleic acids to specific DNA probes bound on strips DNA Extraction 2) Amplification by PCR 4) Evaluation

38 Reaction zones of GenoType® MTBDRplus (examples)

39 GeneXpert:Cepheid folyamat ábra (zárt rendszerű automata)
Nucleinsav tisztítása, koncentrálása Nucleinsav extrakciója, lysise Molekulák összehozása az amplifikációs és detektáló reagenssel Puffer hozzáadása manuálisan Eldobható Cartridge Reakciócsőben végbemenő amplifikáció, detektálás GeneXpert is our second system, currently in development. As I mentioned earlier, GenXpert is the ONLY integrated random access system to incorporate sample preparation. The key to being able to do this is our disposable GeneXpert cartridge Let me describe how it works . . . (quickly walk through the steps that enable you to deliver purified molecules to the reaction tube and show the sample cartridge) minta

40 Xpert MTB/RIF alkalmazási területe
Az assay (Cepheid GeneXpert System) semi-quantitative in-vitro diagnosztikus teszt Az Xpert MTB/RIF Assay a Mycobacterium tuberculosis complex és a rifampicin rezisztencia gyors detektálására szolgáló vizsgálat. Tuberkulózis klinikai gyanúja esetén felnőttek köpet mintájából ajánlják a teszt végzését. Mind a direkt kenetben pozitív (sens: %), mind a direkt negatív (sens:72-91 %) esetekben javasolt a vizsgálat. The Xpert MTB/RIF assay a kezelés monitorozására nem alkalmas Gyors, egyszerűen kivitelezhető, magas szenzitivitás a direkt neg. mintáknál, zárt rendszer, kereszt kontaminációra nem érzékeny, nem igényel különleges biológiai biztonsági feltételeket. Drága? PAGE | 40 * Sept Boehme et colleagues

41 Xpert MTB/RIF alkalmazása extrapulmonális mintáknál
A teszt légúti mintákra van validálva Újabb vizsgálatok szerint extrapulmonális minták esetében (biopsia, genny, liquor stb) is jó a senzitivitása: 81 % és specificitása: 99,6 % Vadwai W et al.: J.Clin.Microbiol July Ugyancsak kitűnő érzékenységet mutatott a teszt a tenyésztéshez viszonyítva vizelet 100 % széklet 100 % esetében Hillemann D. et al..: J.Clin.Microbiol Apr

42 Gyors diagnosztikai molekuláris módszerek rutinszerű alkalmazása
Direkt kimutatás: M.tuberculosis complex ProbeTec GenoType MTBDRplus (HAIN): RMP és INH rezisztencia egyidejű meghat. légúti mintából, kezeletlen beteg mintájából GeneXpert-Rif: RMP rezisztencia egyidejű meghatározása Identifikálás: M.tub.compl elkülönítése, gyakori és ritka NTM azonosítása GenoType MTBC GenoType/CM, AS Rezisztencia vizsgálat I. és II. rendű szerek iránt GenoType MTBDR (HAIN) GenoType MTBDRsl GeneXpert-Rif Vizsgálat ideje: 1-7 nap vs nap

43 Izolátumok hagyományos és molekuláris vizsgálatának leletátfordulás ideje
Hagyományos módszer Molekuláris módszer idő M.tbc.compl.ident. 1-2 hónap HAIN MTBC M.tub.compl.ident M.bovis. M.BCG id. 2-3 nap M.tbc compl. id.és INH+RMP rez. 1-2-3 HAIN MTBDR plus II.r.szerek+ETB rez 2-4 HAIN MTBDrsl Gyakori atypusos NTM identifikálása 2-5 HAIN CM Ritka atypusos NTM identifikálása HAIN AS

44 Köszönöm a megtisztelő figyelmüket!