Citokémiai és immuncitokémiai jelölések

Az előadások a következő témára: "Citokémiai és immuncitokémiai jelölések"— Előadás másolata:

1 Citokémiai és immuncitokémiai jelölések
TEM SEM Coons (1941) LM, fluorescens Singer (1959) EM, ferritin Nakane and Pierce (1966) HRPX Seligman et al. (1968) DAB és Os Faulk and Taylor (1971) arany

2 Immunocitokémiai munka lépései
Alapelv: Mintavétel Előfixálás (Jelölés) Fixálás Víztelenítés Beágyazás Metszés Vizsgálat Krio Ma: főleg arany és peroxidáz technikák

3 Immunogold Faraday (1857) Kolloidális arany vörös
Flokkuláláskor kék lesz Fehérjék stabilizálják a kolloidot Kolloid készítés arany sójának redukciójával Kolloid méret jól szabályozható (1-150 nm) kolloid részecskék jól adszorbeálódnak – megkötnek makromolekulákat a felszínükön Kötődés elektrosztatikus erőkkel NEM BEFOLYÁSOLJA A BIOLÓGIAI AKTIVITÁST!!! Kvalitatív és kvantitatív (de korlátokkal!!!) megfigyelésekre lehetőség Minden műgyantával használható

4 Praktikus kromogén a DAB – LM: barna
Peroxidáz Torma peroxidáz (HRPX) Könnyen extrahálható, tisztítható Reakció: HRPX + H2O2 + kromogén Probléma: endogén peroxidázok vagy pszeudoperoxidatív anyagok aspecifikus háttérjelet adnak Praktikus kromogén a DAB – LM: barna TEM - Os reakció denzebbé teszi (háttért is!) - NaAuCl4 reakció denzebbé teszi (háttért nem!) - ezüst festés HRPX/DAB nem minden gyantánál használható Lowicryl K4M és K11M – nem Lowicryl HM20 és HM23 – igen Kiterjedtebb festés: LM szinten is látható. DE! Laterális felbontás rosszabb! Kolloidális arany és peroxidáz gyakran együtt használt (kettős festésnél figyelni a gyantára)

5 Direkt: primer reagens jelölt ma kevéssé használatos
Kolloid arany Direkt: primer reagens jelölt pr. reagens: antitestek, lektinek, enzimek, ligandok ma kevéssé használatos előny: többszörös jelölés, szubsztrát jelölés hátrány: nagy koncentrációban kell pr. reagens jó jelöléshez 2. Indirekt: primer reagens lokalizációja másodlagos detektációs rendszerrel A. IGS (immunogold staining) primer reagens, szekunder ellenanyag arannyal, sok primerhez azonos szekunder használható, hasonló endogén epitopokra odafigyelni B. Protein A-gold protein A Staphylococcus aureus-ból, ez kötődik az ellenanyagok Fc csoportjához (de nem mindegyikhez!!) bóros protein A – EELS detektáció (kis nagyítás!) C. Protein G-gold protein G Streptococcus-ból (többféle ellenanyaghoz kötődik)

6 3. Haptén (haptenoid) módszer:
D. Protein AG-gold kiméra protein AG, használata az előzőekhez hasonló 3. Haptén (haptenoid) módszer: keresztreakció csökkentő: mesterséges haptén használata pr. reagensre ezt lokalizálja a szekunder detektáció reprodukálhatóság, egyszerűség, olcsóság fontos ne legyen endogén haptén – biotin, DNP A. Biotin Biotin tojás sárgájából, biotines primer reagens Avidin tojás fehérjéből – jól köti a biotint Sztreptavidin Streptococcus-ból – nukleáris fehérjékhez nem kötődik B. Dinitrofenil (DNP) Nincs endogén DNP!!! Kovalensen köthető a reagenshez, oszlopon elválasztható DNP kötött reagens viselkedése nem változik DNP elleni ellenanyag lehet a lokalizáció alapja (IGS, P A, P G, P AG) C. Digoxigenin (DIG) Szteroid Digitalis levelében, virágában – másutt nincs – specificitás! POD, AlkPhosph (0,1 pg érzékenység!)

7

8 Peroxidázos módszerek: Direkt:
kényelmesnek, egyszerűnek tűnik, de nehéz megfelelő pr. reagenst találni, gyakran kicsi az érzékenység 2. Indirekt: két lépésben: pr. reagens lokalizációja szekunder antitesttel, amin peroxidáz (lehet csak hemiantitest, Fab stb.) 3. PAP (peroxidáz – anti-peroxidáz) módszer komplikált bridge technika, peroxidáz és antitesthez kötött peroxidáz felbontás kicsi – komplex nagy Bigbee effektus: bridge ellenanyag kimerül túlzott pr. reagens kötés miatt látszólagos negatív festődés (pr. higítás) „szétfolyó” festődés: rossz felbontás (különösen intenzifikálás után) 4. Haptén (haptenoid) módszer A. Biotin B. DNP C. DIG

9 Kettős jelölések: eltérő arany kolloid, ellenanyagok használata,
arany kolloid és peroxidáz módszerek kombinálása sztérikus gátlás felléphet! Szukcedán és szimultán festések

10 Festés gyakran metszetekben – műgyanta hidrofobitás (pl. epoxi)
penetrációt gátol (kitölt) aspecifikus jelölés Etching (maratás): növeli a festés hatékonyságát epitop kiszabadítás felület növelés Na-ethoxi v. Na-methoxi kezelés: lehető legrövidebb, de akár 1 hét Os kioldás: Os festés maszkolhat, ill. Os kötés lefedhet epitopokat H2O2 kezelés, Na-perjodát kezelés (kontrasztot csökkenti!!) Tripszin kezelés: pH 7,8-on 0,1% tripszin (37 oC) FA rövidebb, GA hosszabb idő PBS v. TBS mosás az emésztés blokkolásáshoz Endogén peroxidázok blokkolása: pikrinsav, sósav, perjódsav, H2O2 kezelés nem specifikus, károsíthat mást is 0,005% H2O2 metanolban jobb (akril gyantában nem!) Aldehid csoportok elreagáltatása: fixálóból, zavarja a festést amino és lizin csoportok érzékenyek NH4Cl, glicin, Na-borohidrid, BSA és OA használata véd, de károsíthat Uranil acetát kioldása: kevéssé károsít, de elfed (csapadékot adhat)

11 Blokkolás inhibiciós – primer antitest előtt
kompetitív – primer/szekunder antitest higításakor de: erős blokkolás a festés intenzitás (antigenitás) csökkenését okozhatja Mosás PBS, TBS jet washing, immersion w., floating w. Kontrollok!!! „Kontrolls are important to know if the result can be trusted with repect to its specificity. Controls must accompany all experiments.” többféle kontroll (treatment and reagent controls) ugyanolyan körülmények, ugyanazok a vegyszerek primer reagens nélküli kontroll higítási kontrollok endogén biotin/PER kontroll szöveti kontrollok pre-immun szérum kontroll (szérum miatti aspecifikus jelölés ellenőrzés)