FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ

Az előadások a következő témára: "FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ"— Előadás másolata:

1 FEHÉJE INTERAKCIÓN ALAPULÓ
TECHNIKÁK Buday László

2 TAP-CÍMKE FEHÉRJE TISZTÍTÁS
-- az eljárást Rigaut és mtsai fejlesztették ki (Nature Biotechnology, 1999, 17: ) -- -- TAP = tandem affinity purification -- a vizsgálandó fehérje mellé két „tag-ot” v. címkét helyezünk (akár C- akár N-terminálisan), melyek a protein A IgG-kötő részét, illetve egy calmodulin -kötő peptidet (CBP) jelentik -- ezeknek a címkéknek a segítségével jó hatásfokkal lehet a vizsgálandó fehéréjét, illetve fehérje komplexeit izolálni

3

4 TAP-CÍMKÉVEL JELÖLT FÚZIÓS FEHÉRJE FELÉPÍTÉSE
TAP-címke protein A CBP vizsgálandó fehérje vagy doménje asszociálódó fehérje TEV proteáz hasítási helye

5 TAP-CÍMKE TISZTÍTÁSI STRATÉGIA
TAP-címkével jelölt fehérjét tartalmazó sejt vagy állat előállítása Sejtkivonat előállítása TAP fehérje tisztítás SDS-poliakrilamid Funkcionális analízis gélelektroforézis (pl. enzimaktivitás mérés) Fehérje azonosítás (pl. tömeg-spektroszkópiával)

6 TANDEM AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA KIVITELEZÉSE
sejtkivonat TEV proteáz IgG oszlopról eluált fehérjék EGTA Ca2+ Kalmodulin gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop IgG gyantát tartalmazó kromatográfiás oszlop IgG IgG Kalm. Kalm. átfolyó fehérjék fehérjék eluálása átfolyó fehérjék fúziós fehérjénk eluálása fehérje CBP prot. A fehérje CBP fehérje CBP fehérje CBP

7 TAP-TAG-Vav2 EXPRESSZIÓJA Cos7 SEJTEKBEN
Anti-nyúl másodlagos ellenanyag + HRP TAP-TAG-Vav2 111 80 61 49 kontrol Vav2 plazmid plazmid

8 TAP-TAG-VAV2 TISZTÍTÁSA COS7 SEJTEKBŐL
173 TAP-TAG-VAV2 111 80 61 kb. 108 tranziensen transzfektált COS7 sejtből izoláltuk a TAP-tag Vav2-t ( 3 db 15 cm-es Petri-csésze) Festés: colloidális Commassie-kék 49 36 kontrol Vav2 plazmid plazmid

9 ÉLESZTŐ KÉT-HIBRID MÓDSZER
Alapelve: a legtöbb eukarióta transzkripciós faktor két fehérje doménből áll: DNS-kötő domén (DKD) aktivátor domén (AD) A DNS-kötő domén a specifikus promóter szekvenciákhoz kötődik, míg az aktivátor domén az RNS polimeráz II-t viszi a promóter részhez Fontos: a két domén csak együtt tud transzkripciót elindítani, viszont megőrzik aktivitásukat, ha más fehérjével fúzionáltatjuk őket Transzkripciós Faktor (TF) pl. GAL4 polimeráz AD DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

10 MI TÖRTÉNIK, HA A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT DOMÉNJÉT
KETTÉVÁGJUK, S EGY-EGY PLAZMIDDAL JUTATJUK BE A CÉLSEJTBE? Plazmid II., mely az AD-t tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t tartalmazza polimeráz AD DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

11 A TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR KÉT KETTÉVÁGOTT DOMÉNJÉHEZ
KÜLÖN-KÜLÖN TETSZŐLEGES FEHÉRJÉKET LEHET KÖTNI Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza polimeráz AD csali fehérje könyvtár DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

12 HA A CSALIFEHÉRJE KÖTŐDNI TUD AZ EXPRESSZIÓS KÖNYVTÁR
EGYIK FEHÉRJÉJÉHEZ, AKKOR MEGINDUL A TRANSZKRIPCIÓ Plazmid II., mely az AD-t és egy expressziós könyvtár génjeit tartalmazza Plazmid I., mely DKD-t és egy csali- fehérje génjét tartalmazza polimeráz AD csali fehérje könyvtár DKD transzkripció Reporter gén TF-kötő DNS promóter szakasz

13 cDNS expressziós könyvtár
egyes klónjai petri csészén A pirossal jelzett klónokban a csali fehérje kötődni tudott az éppen az abban a klónban expresszálódó fehérjéhez, s a riporter gén „megszólalt” Izolálni kell a kiválasztott klónt, s szekvenálni a benne lévő cDNS darabot

14 pGEX GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (GST) EXPRESSZIÓS RENDSZER
--- Tetszőleges fehérje, vagy fehérje domén nagy mennyiségben E. coli-ban történő expresszálására Polilinker v. Multicloning site Lac promóter IPTG GST Represszor fehérje pGEX Lac inhibitor gén Ampicillin rezisztencia gén Ori

15 pGEX GST és X FEHÉRJÉT TARTALMAZÓ VEKTOR Lac promóter X vizsgálandó
fehérje génje GST GST X FEH. pGEX GST FÚZIÓS FEHÉRJE Ampicillin rezisztencia gén Ori

16 GST-X FÚZIÓS FEHÉRJE TISZTÍTÁSA BAKTÉRIUMBÓL
AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL GLUTATION X FEH. A baktérium kivonatához glutationt adunk, mely kovalensen van kötve valamilyen gyantához Enzim-szubsztrát kölcsönhatás Ha megmossuk a gyantát akkor a bakteriális fehérjéket el lehet távolítani GST GLUTATION Sepharose matrix GLUTATION GST X FEH. GLUTATION GST X FEH.

17 GST-FÚZIÓS FEHÉRJE ELUÁLÁSA AZ OSZLOPRÓL NAGY
FELESLEGBEN ADOTT SZABAD GLUTATIONNAL TÖRTÉNIK GLUTATION GLUTATION GLUTATION GLUTATION GST X FEH. GLUTATION GLUTATION Sepharose matrix GLUTATION GLUTATION GST X FEH. GLUTATION GLUTATION GLUTATION A felesleges glutation dialízissel lehet eltávolítani. GLUTATION

18 X-FEHÉRJE EMÉSZTÉSE A GST FEHÉRJÉRŐL
Trombin hasítási hely található a GST és a X fehérje között. X FEH. GLUTATION GST GLUTATION Sepharose matrix X FEH. GLUTATION GST X FEH. GLUTATION X FEH. GST X FEH.

19 PÉLDA A GST-FEHÉRJÉK ALKALMAZÁSÁRA
FEHÉRJE-FEHÉRJE INTERAKCIÓK KAPCSÁN Korábban kimutattuk, hogy az NCK kapcsoló fehérje megköti a dinamint. Utóbbi fehérjének fontos szerepe van számos receptor down-regulációjában, illetve az endocitózisban. SH3 SH3 SH3 SH2 NCK szerkezete ? ? ? dinamin A dinamin képes az NCK egyik SH3 doménjéhez kötődni, de melyikhez?

20 PCR SEGÍTSÉGÉVEL ELKÉSZÍTETTÜK AZ EGYES
SH3 DOMÉNEKET TARTALMAZÓ GST FÚZIÓS FEHÉRJÉKET SH3-1 SH3-2 SH3-3 SH2 Nck GST SH3-1 SH3 domének PCR-e GST SH3-2 GST SH3-3 pGEX SH3-1 SH3-2 SH3-3

21 AZ EGYES GST-SH3 DOMÉN FEHÉRJÉK TISZTÍTÁS UTÁNI KÉPE
Az egyes SH3 doméneket tartalmazó GST fúziós fehérjéket Glutation-Sepharoz affinitás oszlopon megtisztítottuk, majd a GST fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk. A fehérjéket Coomassie-kék festékkel tettük láthatóvá. Nck SH3-1 SH3-2 SH3-3 SH3-1 SH3-2 SH3-3

22 A DINAMIN AZ NCK HARMADIK SH3 DOMÉNJÉHEZ KÖTŐDIK
Anti-dinamin Western-blot Kísérlet rövid leírása: Az elkészített GST-SH3 doméneket Glutation-Sepharose gyantám hagytuk a tisztítást követően. A gyantákat sejtkivonatba mártottuk, majd alaposan megmostuk, s anti-dinamin Western-blottal vizsgáltuk, hogy melyik SH3 domén köti a dinamint.

23 ZÖLD FLUORESZKÁLÓ FEHÉRJE RENDSZER (Green fluorescence protein, GFP)
-- egy medúza fajból izolált természetes fluoreszkáló fehérje -- pontmutációk segítségével fokozni lehet a fluoreszcenciát (EGFP = enhanced green fluorescence protein) -- a vizsgálandó fehérje N- és C-terminálisához egyaránt hozzá lehet fűzni -- lehetőséget biztosít a vizsgálandó fehérje élő sejten belüli követésére -- a GFP rendszer kimeríti mind expressziós rendsz, mind a riporter rendszer, mind az epitóp-címkézés fogalmát, ugyanis kiváló mono- lonális ellenanyag kapható a GFP rész ellen GFP vizsgálandó fehérje

24 pEGFP vektorok (Clontech cégtől)
N-terminális GFP C-terminális GFP GFP fehérje fehérje GFP

25 GFP-Vav2 EXPRESSZIÓJA ÉS HATÁSA AZ AKTIN
CITOSZKELETONRA COS7 SEJTEKBEN GFP TRITC- Phalloidin TRITC- Phalloidin GFP-Vav2

26 GFP FÚZIÓS FEHÉRJÉKKEL ELKERÜLHETŐ A WESTERN-BLOTTAL VALÓ MUNKA
ugyanis a gélt elég floureszcencát mérni tudó Gél-dok rendszerbe beletenni: a GFP fehérjék világítani fognak SDS-poliakrilamid gélelektoforézis

27 FAR-WESTERN-BLOT TECHNIKA
A hagyományos Western-blot eljárás módosított változata, mely fehérje- fehérje interakciók kimutatására szolgál. Lényege: a fehérje elegyet a szokásos módon SDS-poliakrilamid gél- elektroforézis segítségével elválasztjuk, majd a fehérjéket membránra (PVDF, nitrocellulóz) blottoljuk át. Itt azonban nem az átblottolt fehérjéket mutatjuk ki elsődleges, illetve másodlagos ellenanyagok hozzáadásával, hanem a blottolást követően egy szolubilis fehérjével inkubáljuk a membránt, ami kötődik az általa felismert fehérjékhez. Ez után a szolubilis fehérje elleni elsődleges, majd másodlagos ellen- anyagok segítségével detektálhatjuk azokat a membránhoz-kötött fehérjéket, melyekhez a szolubilis fehérje kikötődött.

28 FAR-WESTERN-BLOT MENETE
blottolás SDS-PAGE gél Nitrocellulóz membrán

29 INKUBÁLÁS SZOLUBILIS FEHÉRJÉVEL
Nitrocellulóz membrán Kötődik az egyik fehérjéhez a membránon

30 A SZOLUBILIS FEHÉRJE KIMUTATÁSA ELLENANYAGOKKAL
Inkubálás másodlagos ellenanyaggal Inkubálás elsődleges ellenanyaggal torma peroxidáz

31 KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓS TECHNIKA
A legtöbb fehérje a sejtben más fehérjékhez kötve helyezkedik el. Ha a komplex egyik fehérjéje ellen termelt ellenanyaggal immun- precipitáluk a fehérjét, megfelelő körülmények között a komplex többi tagja is immunprecipitálódni fog. B A Sepharose gyanta C Protein A anti-C elleni ellenanyag

32 PÉLDA A KO-IMMUNPRECIPITÁCIÓRA
EGF receprtor Grb2 P SH3 SH2 SOS SH3