Portoktenyésztés = in vitro androgenezis

Az előadások a következő témára: "Portoktenyésztés = in vitro androgenezis"— Előadás másolata:

1 Portoktenyésztés = in vitro androgenezis

2 In vitro technikák Mikroszaporítás: szomatikus sejteket tartalmazó szövetekből indul ki Diploid technika: embrió kultúra Haploid technika: androgenezis mikrospóra tenyésztés ginogenezis: ovárium (magház kultúra) ovolum (magkezdemény kultúra)

3 Haploid szövettenyésztési technika.
Lényege: A fejlődés megfelelő stádiumában lévő pollent tartalmazó portokok kipreparálása és a benne fejlődő mikrospórából androgenezis indukciója steril, mesterséges körülmények között. Az egyedfejlődés gametofitonról sporofitonra lehet átállítani megtermékenyítés nélkül, mesterségesen.

4 Cél Haploid egyedek előállítása, amelyek kromoszómaszerelvénye spontán duplikációval, vagy mesterséges indukcióval megduplázódhat, így homozigóta dihaploid egyedek jönnek létre. In vivo fejlődési útról teljesen új sporofita útra történő átirányítás

5 Jelentősége * Irányított keresztezésekhez szükséges tiszta vonalak kialakítása, fenntartása *Recesszív tulajdonságok fenotípusos megjelenítése * Gametoklonális változás nyomonkövetése ill. felhasználása nemesítésre * Idegentermékenyülő növények beltenyésztési ideje csökken * GM növényeknél a génre nézve homozigóták létrehozása * A különböző faj- és nemzetségkeresztezésekben a haploidia lehetővé teszi hibridek előállítását (pl. Triticale ) * Az öntermékenyülő fajok F1 és F2 növényei, vagy F6, F7 nemzedékben még hasadó vonalai, törzsei egy generáció alatt rögzíthetők * Genetikaliag tiszta vonalak molekuláris markerezéshez, géntérképezéshez

6 Története 1930-as években első portoktenyésztéssel kapcsolatos kutatások: mikrosporogenezis és gametogenezis vizsgálata 1952: La Rue nyitvatermő pollenjének szövetszerveződésének bemutatása : Guha és Maheshwari: Datura innoxia pollenjéből nagy számú pollenhaploidot nevelt portokkultúrában. 60-as végétől Nitsch, Niizeki és Oono pollen haploid előállítása Nicotiana, Oryza fajokból Napjainkban 80 nemzetség kb. 300 fajánál sikerült pollen haploidot előállítani

7 Mikrogametogenezis Sporofita életszakasz vége
Ideális állapot, elvileg totipotensek!!! Sporofita életszakasz vége Pollendimorfizmus elmélete: az izolált portokban kétféle pollen van Androgén (P) pollen Kevés citoplazma Kevés keményítő

8 Sikeres androgenezis feltétele
Nem determinált, androgén mikrospóra Ontogenezis indukálása valamilyen stresszel (hő, éheztetés, 2,4D) Sejtciklus megfelelő fázisában lévő mikrospóra (G2)

9 Androgenezis útja Soksejtes pollen kialakulása:
Ontogenezis indukálása stressz hatására mikrospórákból Sporofita osztódások Közvetlen embriogenezis, vagy kalluszon át embriogenezis/ organogenezis Soksejtes pollen Pollen H/DH Soksejtes pollen kialakulása: *A típus: aszimmetrikus mitózis: nagy vegetatív sejt, ez tovább osztódik, a kicsi generatív degenerálódik *B típus: szimmetrikus mitózis: 2 hasonló diffúz sejtmag: belőle haploid sporofiták fejlődése C típus: szimmetrikus mitózis után a két sejtmag fúzionál: dihaploid (DH) növény fejlődése

10 Androgenezis módszere
Donor növények nevelése Tenyésztési feltételek: Reszponzív vonalak szelektálása Virágzás eleji androgénebb pollen N hiány Alacsony hőmérséklet

11 2. Portok preparálás

12 3. Androgenezis indukció. 1/2 MS táptalaj
3. Androgenezis indukció *1/2 MS táptalaj *Vas fontos, ezért Fe-EDTA kiegészítés * Stressz indukció: magas 2,4D vagy magas NaCl

13 4. Inkubáció Inkubáció előtt a steril táptalajra rakott portokok hideg kezelése rövidebb- hosszabb ideig Kallusz vagy embrió megjelenésig sötét, 25-30Co Regeneráció: lux

14 5. A regenerálódott növények ploid szintjének vizsgálata flow cytométerrel történt.

15 6. Doubled haploid (DH) növények előállítása * Spontán rediploidizáció
* Kolhicin kezelés táptalajba vagy a regenerálódott növény kolhicin oldatos kezelése

16 Izolált mikrospóra tenyésztés
Előnyei: Portoktenyészeteknél regenerált növények eredete kérdéses Mikrospórák közvetlenül érintkeznek a táptalajjal, biológiai szűrő kiesik.

17 Mikrospóra izoláció módszere
Egysejtmagvas és korai kétsejtmagvas pollenek izolálása virágok feldarabolásával Homogenizálni robotgéppel spec. oldatban (pl. 0,3M mannitol) Szűrés nylon szűrőn Táptalajok azonosak a portoktenyésztéssel