Globális tesztek a hemosztázis vizsgálatában

Az előadások a következő témára: "Globális tesztek a hemosztázis vizsgálatában"— Előadás másolata:

1 Globális tesztek a hemosztázis vizsgálatában
Dr. Várnai Katalin Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)

2 Globális tesztek A hemosztázis rutin tesztjei a diagnosztikus lépések alapjait képezik. A vizsgálatok közege thrombocyta szegény vagy thrombocyta mentes plazma, így a hemosztázis elemeinek komplex hálózatát nem érzékelik. A mérések végpontjánál a trombin kb. 5% keletkezik. Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). A rutin tesztek érzékenysége a hiperkoaguláció irányában is elégtelenek. A prokoaguláns aktivitású mikropartikulák mérése segíthet ezen állapotok kimutatásában.

3 trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM).
Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

4 Trombin Generációs Teszt
A hemosztázis kitüntetett faktora a trombin, keletkezésének és gátlásának szabályozása kulcskérdés. Az endogén trombin potenciál (ETP) a pro- és anti-koagulációs folyamatokat tükrözi, így alkalmas a hipo- és hiperkoagulabilitás kimutatására. Helye van: diagnosztikában, terápia követésében, hemosztázis gén-gén kapcsolatokban új variánsok, trombózis rizikó vagy védőfaktorok felismerésében.

5 Trombin Generáció (TG)
A trombin a véralvadási rendszer kulcs enzime A trombin az alvadási folyamat enzimatikus szabályozásában kettős szerepet tölt be Alvadási faktorok aktiválása → prokoaguláció Protein C út beindítása → antikoaguláció TG: a trombin aktivitás változásának meghatározása az idő függvényében A klasszikus („clot-based”) alvadási tesztek csak <5% trombin képződéséig mérnek Idő Trombin aktivitás ETP Lag time Maximális aktivitás elérésének ideje Maximális aktivitás ETP: endogén trombin potenciál Prokoagulációs szakasz Antikoagulációs szakasz Kern Anita /13 I. félév

6 Trombin Generációs Teszt
A trombin generáció görbe jellemzői: lag fázis (t_lag): a plazma alvadási idejével egyezik, trombin csúcs (C_max), csúcsig eltelt idő (t-max): az alvadási folyamat kiterjesztését jelenti, görbe alatti terület (AUC), az endogén trombin potenciál: a trombin aktivitás ideje alatt képződött teljes trombin mennyiségét fejezi ki. A TGT több variációja ismert, amelyek a reakcióban résztvevő komponensektől függően eltérő érzékenységet mutatnak az alvadási faktorok, inhibitorok, thrombocyták működésére. Fibrinolízisre szenzitív reakcióelegy kialakítása még várat magára.

7 Trombin generációs teszt - tulajdonságok
Előnyök Globális teszt: valamennyi pro- és antikoaguláns folyamat megnyilvánul benne A mérési körülmények változtatásával adott funkció specializált meghatározására alkalmazható Platelet-rich plasma (PRP)/Platelet-poor plasma (PPP) Indukálás: TF koncentráció, foszfolipid koncentráció és összetétel Protein C út vizsgálata (APC, szolubilis TM hozzáadása) Lineáris összefüggés a klinikai képpel Hátrány Nehéz megtalálni a megfelelő mérési körülményeket Az egyes laborokban mért eredmények nehezen összevethetők Kern Anita /13 I. félév E Castoldi, J Rosing Thrombosis Research (2011) 127, S21-S25

8 Trombin Generációs Teszt
A TG első metodikáját 1953-ban közölték le. A módszer manuális és időigényes volta miatt nem terjedt el. Számítógép vezérelte, kromogén szubsztrátos változata nagy előrelépést jelentett a nyolcvanas években. Fluorogén szubsztrát bevezetésével a trombin generáció fibrinogén/fibrin tartalmú plazmában és thrombocyta dús plazmában is mérhetővé vált. A módszer pontosságát fokozta az automaták alkalmazása, de a standardizálás, az eredmények normalizálása napjainkban is zajlik.

9 Trombin generációs tesztek - történet
1950-es évek: első TG-s mérések Alvadó vér, vagy plazma mintából vett alikvotok fibrinogénen mért alvadási idejéből a trombin aktivitás meghatározása Félautomata módszerek kromogén szubsztráttal Alikvotok koncentrációmeghatározása kromogén szubsztráttal Defibrinált plazmát igényel (fényszórás zavarja az optikai mérést) α2-makroglobulin:trombin komplexet aktív trombinnak méri Automata módszerek kromogén szubsztráttal A kromogén szubsztrát hozzáadása az alvadó plazmához Automata módszerek fluorogén szubsztráttal Nem igényel defibrinálást, akár teljes vér is használható Kern Anita /13 I. félév

10 Mérési eredmények értékelése
Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita /13 I. félév

11 Mérési eredmények értékelése
Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita /13 I. félév

12 Mérési eredmények értékelése
Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita /13 I. félév

13 Trombin Generációs Teszt
A trombin-képződés kinetikáját sok tényező befolyásolja, így az alvadási faktorok és inhibitorok mennyisége, milyensége; a szöveti faktor és egyéb stimulánsok; valamint a thrombocyták mennyisége és funkciója. Az automatizált metodika (Calibrated Automated Thrombogram, CAT) trombin szubsztrát kinetikáját méri a felszabaduló kromofór vagy fluoreszcens jel alapján, és szoftver program segítségével számítja ki a trombin aktivitását.

14 Triger koncentráció hatása
Kern Anita /13 I. félév

15 Szöveti faktor / Foszfolipid arány hatása
Kern Anita /13 I. félév

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28 TG klinikai alkalmazási lehetőségei
Antikoaguláns terápia követése: A különböző támadáspontú antikoagulálás közös pontja a trombin generáció csökkentése. A K-vitamin antagonisták a protrombin-trombin átalakulást fékezik. A frakcionálatlan heparin az antitrombin-trombin gátlást fokozza több nagyságrenddel. A direkt trombin gátlók az aktív centrumot gátolják, a direkt anti-Xa-szerek pedig a tenáz komlexben levő faktort blokkolják. A TG globális teszttel ezek a különböző támadáspontú hatások egy rendszerben követhetők. Hiperkoagulabilitás meghatározása: Ha a TG a szöveti faktort (TF) alacsony vagy magas koncentrációban tartalmazza, és trombomodulinnal (TM) vagy aktivált protein C-vel (APC) egészíti ki, a rendszer alkalmassá válik fokozott alvadási készség kimutatására. Fokozott vérzékenység kimutatása: A teszt érzékeny a csökkent alvadási kapacitás kimutatására, így alkalmas lehet szerzett hígulásos alvadászavar (műtéti hemodilúció) vagy öröklött vérzékenység faktorpótlásának meghatározásában.

29

30

31

32

33

34 trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM).
Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

35 Trombelasztográfia (TEG)
A Hartert (1948) által feltalált műszerrel a teljes vér viszko-elasztikus tulajdonságai, az alvadék képződésének, stabilitásának és oldékonyságának dinamikája követhetővé váltak. A vérben alacsony, a vénás áramlást imitáló nyírófeszültség mellett zajlik az alvadás az indukciótól a fibrinolízis bekövetkeztéig. Az akár órákig is eltartó folyamat mérése ilyen formában nem tudott a diagnosztika fegyvertárába bekerülni.

36 Trombelasztográfia (TEG)
A technikai változtatások ma már a point-of-care diagnosztika részévé tették. A TEG fejlesztett változata a rotációs trombelasztometria (ROTEM). Teljes vér (natív vagy citrátos) vagy plazma kerül az egyszer használatos küvettába, amelybe egy függőleges tengely körül rotációs mozgást végző henger merül. Az alvadék képződése a rotációs mozgást lefékezi. A mozgás változását a műszer matematikai transzformációval alvadék erősséggé számolja (amplitúdó/mm), és az idő (sec) függvényében ábrázolja. A szoftver grafikusan és számérték szerint is elemzi a trombelasztogramot.

37 Haemoscope TEG® Figure 8 37

38 ROTEM® instrument Figure 9 38

39 TEG ROTEM

40 TEG R Indítástól az alapvonaltól 2 mm eltérésig eltelt idő (alvadási idő, CT; alvadási faktorok és inhibitorok egyensúlya) K Alapvonaltól (2 mm) 20 mm-ig eltelt idő (alvadék képződési idő, CFT) Α TEG kezdeti meredeksége (2 mm-nél levő meredekség; az alvadék keletkezésének sebessége) MA Maximális amplitúdó (MCF, az alvadék erőssége, stabilsága: thrombocyta-fibrinogén interakció, fibrin polimerizáció) G Az alvadék rugalmassága (MCE) CL30 Az alvadék lízise adott időben. TTL A fibrinolízis elindulásához szükséges idő (MA-tól 2 mm; fibrinolízis aktivitás, FXIII). A natív mintát 3 percen belül kell mérni, a citrátos minta négy óráig stabil. Aktivátor nélküli mérés percig, míg aktivátorral kb.10 percen keresztül tart. A ROTEM nemcsak globális képet ad a beteg hemosztatikus állapotáról, hanem differenciál diagnosztikai eszközként is használható a tesztek módosításával.

41 ROTEM Az EXTEM alap teszt, amelyben rekombináns TF indítja az alvadást. A maximális alvadék erősség (MCFEXTEM) főként a thrombocyták működésétől és a fibrinogén szinttől függ, és ha a küvetta thrombocyta gátlót (cytochalasin D) tartalmaz, szerepük szétválasztható. MCFFIBTEM méri a fibrinogén hatását az alvadék erősségében. Az MCF kritikus értéke 15 perc, e fölött fibrinogén koncentrátum adása jön szóba. Normál MCFFIBTEM (>12 mm) és alacsony MCFEXTEM (< 5 mm) thrombocyta pótlást indikál. CTEXTEM jelzi a csökkent alvadékonyságot is, a faktorpótlás (FFP, PCC) küszöbértéke 100 sec. Az EXTEM alapteszt és fibrinolízis gátló (aprotinin) tartalmú teszt (APTEM) együttes meghatározásával kisfokú hiperfibrinolízis is kideríthető, ha a két méréssel kapott értékek hányadosa <0,8 (CTAPTEM/ CT EXTEM ).

42 ROTEM Az INTEM (APTI-hez hasonló kontakt aktiváció) általános alvadási státusz megítélésére, HEPTEM heparináz tartalommal heparin hatás, ecarinnal pedig speciális antikoaguláns mérésre (hirudin) alkalmas. A ROTEM masszív vérzéseknél segítséget jelenthet a döntések meghozatalában, terápia indításában. Sebészeti vérzésnél elsőként az EXTEM és a FIBTEM szimultán végzése ajánlott. Az INTEM és a HEPTEM meghatározás elsőként heparinizált betegnél indokolt, második lépésként pedig bármely sebészeti betegnél, ahol a heparinizáció a vérzéshez hozzájárulhat. A TEG alkalmassá tehető a thrombocyta blokkolókra (aszpirin, clopidogrel) non-responder vagy hiper-responder egyedek kiszűrésére. A trombin a legerősebb trombocyta agonista, és ha gátoljuk, a többi agonista hatása megítélhetővé válik. A mérőrendszerben a heparin gátolja a trombint, a hozzáadott reptiláz és F XIIIa fibrinhálót képes kialakítani a thrombocytákkal együttműködve. Arachidonsav vagy ADP hozzáadásával az MA közel normális lesz, kivéve azoknál, akik aszpirinre, vagy clopidogrelre megfelelően reagálnak.

43 Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG),
trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

44 Mikropartikulák A plazmában jelenlévő mikropartikulák (MP) észlelése évtizedekkel korábbra tehető. Megfigyelték, hogy nagy sebességű centrifugálás után a plazma alvadási ideje megnyúlik, tehát a centrifugálással prokoaguláns részecskék távolítódnak el a plazmából. Az utóbbi években ráirányult a figyelem a sejtekből leváló mikropartikulák hemosztázisban játszott szerepére. Forrásuk: a keringésben levő elemek közül a thrombocyták (70-90%), illetve a vörösvértestek, fehérvérsejtek, a helyhez kötöttekből pedig az endothel. A thrombocytákból származó MP (PMP) keletkezhet thrombocyta aktiváció során, megakariocytákból a megakaryopoiesis során, vagy a vérlemezkék apoptózisa esetén. Egyéb sejtekből szintén aktiváció, interakció vagy apoptózis eredményez MP képződést. A részecskék lefűződött membrán darabok, foszfolipid tartalmú vezikulák, a forrásuknak megfelelő sejt-markereket hordoznak. Méretük 0,1 - 1 μm. Főbb összetevőjük: fehérje, foszfolipid, de mRNS-t és priont is hordozhatnak.

45 MP képződése

46 MP Egyensúlyi állapotban a membrán-foszfolipidek aszimmetrikus elrendeződést mutatnak, ez három enzim működéséhez kötődik: flipáz, flopáz és szkrambláz. A flipáz a foszfatidil-szerint (PS) és foszfetidil-etanolamint (PE) kívülről beforgatja, a flopáz foszfolipideket mozgat kifelé. A szkrambláz foszfolipid transzportot végez a membrán két monolayere között, egyensúlyi állapotban inaktív. MP feltételezett képződési mechanizmusa a sejt aktiválódásakor vagy apoptóziskor: a felszabaduló Ca++ enzimeket aktivál, melyek membrán átrendeződést okoznak. Emellett aktiválja a kalpain enzimet, amely a fehérjék és a citoszkeleton közötti kapcsolat megszűnéséhez, ezáltal a membránból MP lefűződéshez vezet. A MP foszfolipid tartalmának nagy százalékát általában PS és PE adja, kivéve, ha endothel sejtből apoptózissal keletkeznek, ekkor az annexin V tartalom magas. A MP fehérje tartalma is változhat, pl. a PMP trombin vagy kollagén aktiváció után GP IIb/IIIa komplexet tartalmaz, míg komplement aktiváció után nem.

47

48 MP MP meghatározása: Mérőeszközökből csak módosított impedancia FlowCytometer használható. Másik lehetőség szolid-fázishoz kötődésen alapszik (annexin/antitest), ahol a mennyiség mellett a prokoaguláns aktivitás mérhető, de ez nem alkalmazható minden esetben. A PMP prokoaguláns aktivitása szorosa az ugyanakkora aktivált thrombocyta felszínnek. Ennek magyarázata a TF jelenléte. A sérülés helyén az aktivált endothel sejtből és thrombocytából protein diszulfid izomeráz szabadul fel, amely konformáció változást okoz a TF-ban, így felgyorsul a komplexképződés a TF-FVIIa-FXa között. A TF-MP monocytákból is származhat (MMP), amely P-szelektin ligandot (PSL-1) is hordoz.

49

50 MP A keringő MP mennyisége emelkedhet különböző patológiás állapotokban: Trombózis (VTE, HIT-II, TTP, PNH, sarlósejtes betegség) Kardiovaszkuláris betegség (hipertenzió, hiperlipidémia, atherosclerosis, akut koronária szindróma) Infekció (szepszis, HIV, prion betegség). A MP patológiai szerepe miatt szükséges a keletkezésük, aktivitásuk behatóbb ismerete, és a metodikák standardizálása.