Tisztítási próba poliakrilamid gélelektroforézissel

Az előadások a következő témára: "Tisztítási próba poliakrilamid gélelektroforézissel"— Előadás másolata:

1 Tisztítási próba poliakrilamid gélelektroforézissel
(PAGE) 1

2 1. A minták előkészítése a PAGE-hez
1.1 Mérjen ki 20 µl-t a BL, W1, E1 és E2 jelölésű kémcsövekből az ezeknek megfelelő új kémcsövekbe.

3 1. A minták előkészítése a PAGE-hez
1.2 Mérjen ki 20 µl “Lämmli puffert” az új kémcsövekbe. 1.3 Rázogatással keverje fel őket.

4 2. A gélkazetták előkészítése
2.1 A fekete vonal mentén vágja fel a PAGE gél csomagolását és vegye ki a gélkazettát.

5 2. A gélkazetták előkészítése
2.2 Húzza le a zöld szalagot a gélkazetta alján.

6 A kamra előkészítése

7 3. Az elektroforézis kamra előkészítése
3.1 Rakja a gélkazettát a rövidebb végével befelé fordítva az elektród- kamrába. Rakjon egy másik gélkazettát a kamra másik oldalára. 3.2 Helyezze el az elektród állványt a szorító keret közé és zárja be a pántokat.

8 3. Az elektroforézis kamra előkészítése
3.3 Rakja be a szorító keretet benne az elektród-kamrával a puffer tartályba.

9 4. A kamra feltöltése 4.1 Töltse fel az elektród állványt TGS pufferrel amíg az teljesen meg nem telik. 4.2 Töltse fel a puffer tartályt a maradék TGS pufferrel. 4.3 Húzza ki a fésűt.

10 5. A gél nyílások feltöltése
Töltse fel a nyílásokat a következőkkel: 1. 10 µl Kaleidoskope fehérje standard (KS) 2. 20 µl baktérium lizát (BL) 3. 20 µl tisztító puffer (W1) 4. 20 µl eluens (oldat) (E1) µl eluens (E2) A második csoport a 6-10-es nyílásokat tölti fel ugyanígy.

11 6. Az elektroforézis végrehajtása
6.1 Zárja be a gélkamrákat és kezdje meg az elektroforézist 200V-on. 6.2 Amikor a Bróm-fenol kék eléri a gél alsó végét, állítsa le a folyamatot

12 7. A gélkazetták eltávolítása
7.1 Távolítsa el a szorító keretet és öntse bele a puffert a konténerbe 7.2 Távolítsa el a gélkazettákat.

13 8. Elemzés 8.1 UV fény alatt jelölje be GFP sávokat

14 8. Elemzés Diagram: Kaleidoszkóp Standard molekuláris tömege Colour
kDa Blue 250 kDa Violet 150 kDa 100 kDa Magenta 75 kDa 50 kDa Green 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa Yellow 10 kDa Diagram: Kaleidoszkóp Standard molekuláris tömege

15 9. A gél eltávolítása 9.1 Nyissa ki a gélkazettát és tegye a gélt egy üres festékes tálcára. 9.2 Vízzel 2 percig öblítse át a géleket. 9.3 Fesse a gélt 15 percig 100 ml Coomassie oldattal.

16 9. Fehérje festés 9.4 Öntse vissza a Coomassie festőoldatot a tartó üvegébe és öntsön a gélre 100 ml langyos vizet. A gélt egy éjszakára a hagyja a vízben

17 10. Az eredmények megvitatása
Vizsgálják meg a kromatográfiával történő tisztítás eredményeit, és vonják le következtetéseiket.