Új molekuláris biológiai módszerek labor

Az előadások a következő témára: "Új molekuláris biológiai módszerek labor"— Előadás másolata:

1 Új molekuláris biológiai módszerek labor
Tervezési feladat Tárgyfelelős: Dr. Wunderlich Lívius Készítette: Czobor Ádám, Hajdinák Péter

2 A feladat áttekintése Háttéradatok gyűjtése
Az adott fehérje ismertetése A szükséges gén megkeresése Konstrukció és expresszió megtervezése Vektorok és endonukleázok kiválasztása PCR primerek és reakció tervezése, termék tisztítása A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Az expresszió megtervezése, a termék kinyerése, tisztítása A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása

3 Háttéradatok gyűjtése I. A fehérje bemutatása
A fehérje mérete, szerkezete (poszttranszlációs módosítások) A fehérje funkciója (élettani szerep, felhasználás) 165 AS 2 diszulfid-híddal MW: kb Dalton Szénhidráttartalom: kb. 40%

4 Háttéradatok gyűjtése II. A szükséges gén megkeresése
Internetes adatbázisok (pl: NCBI: ) Intron, exon beazonosítás cDNS A gén adatainak megadása: Accession number (link) Méret Gazdaszervezet AA szekvencia (ellenőrzés végett)

5 Konstrukció és expresszió megtervezése I
Konstrukció és expresszió megtervezése I. Vektorok és endonukleázok kiválasztása Bakteriális expresszió baktérium plazmid Szelekció (antibiotikum, pl.: Amp) Riporter gén (pl.: LacZ) Indukció (pl.: IPTG) Tisztítás (tag) Egyéb lehetőségek (pl.: antitest, fluorofór) Alkalmazandó törzs (klónozó, expressziós) Endonukleázok ((1) vagy 2 darab) Génen nincs hasítás!!! Plazmidon hasítás CSAK a MCS-ban

6 Konstrukció és expresszió megtervezése II
Konstrukció és expresszió megtervezése II. PCR primerek és reakció tervezése, a termék tisztítása Primerek (hasítóhelyek kialakítása) START, STOP kodon meglétének ellenőrzése (plazmidon) Méret: hasonló méret, kb bp (specifikusság) Olvadáspont ellenőrzése (max. 3-5°C eltérés) tapadási hőmérséklet Hajtűképzés elkerülése (egymás utáni, ill. láncvégi G,C-k) Komplementáció elkerülése (dimer képzés minimalizálása) 5’-3’ irányultság! Reakció megtervezése Tapadási hőmérséklet A paraméterek (idő, hőmérséklet) beállítása a gyártó által megadottak alapján (polimerizációs idő gén mérete)

7 Konstrukció és expresszió megtervezése III
Konstrukció és expresszió megtervezése III. PCR termék tisztítása, kinyerése Agaróz gélelektroforézis Teljes preparátum Teszthasítás – több enzim, több kombináció biztosabb eredmény (kis mennyiség) Normál hasítás (nagy mennyiség, kíméletes bánásmód, csak a szükséges enzimek) Visszanyerés (gélből tisztítás)

8 Konstrukció és expresszió megtervezése IV
Konstrukció és expresszió megtervezése IV. A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Ligálás Tisztított, hasított (beillesztéshez szükséges módon) PCR termék Hasított (beillesztéshez szükséges módon) plazmid Ligáz enzim (pl. T4) A gyártó által megadott módon. Koncentráció/méret egyeztetése. Transzfomálás Kompetens sejt (klónozó törzs – fenntartás/szaporítás, fagyasztás) A ligálás terméke A gyártó által megadott módon. Ellenőrzés Szelekciós tápközeg (szélesztés) Miniprep (kit) Hasítások + agaróz gélelektroforézis; szekvenálás

9 Konstrukció és expresszió megtervezése IV
Konstrukció és expresszió megtervezése IV. A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Az ábrák SerialCloner programmal készültek.

10 Konstrukció és expresszió megtervezése V
Konstrukció és expresszió megtervezése V. Expresszió megtervezése, a termék kinyerése, tisztítása Transzformálás expressziós törzsbe Ellenőrzött, inszertet tartalmazó plazmid (miniprep) Expressziós törzs (kompetens sejt) A gyártó által megadott módon. Fehérje termeltetése Sejtszaporítás (szelekció) Indukció (pl. IPTG) A termeltetett fehérje tisztítása (koncentrálása) Affinkromatográfia (extra régiók eltávolítása?) Membránszűrés Dializálás

11 A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása
Mennyiségi elemzés Fotometria: 280 nm Reagens felhasználásával (pl.: Coomassie) A gyártó által megadott módon. Minőségi elemzés PAGE/SDS-PAGE (+ több dimenziós, gradiens) Aminosav analizátor Tömegspektrometria (pl.: LC-MS) Kombinált minőségi és mennyiségi elemzés Western blot Termék módosítása Az extra szakasz eltávolítása Plazmidfüggő módszer. A gyártó által megadottak szerint.

12 Összefoglalás Háttéradatok gyűjtése
Adatok, szekvenciák Konstrukció és expresszió megtervezése Alapanyagok Vektor létrehozása (inszert, plazmid) Klónozás Expresszáltatás, tisztítás A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása Mennyiségi és minőségi analízis Extra szakasz eltávolítás

13 Formai követelmények Elrendezés: Fedőlap; tartalomjegyzék + a kiadott mintajegyzőkönyv alapján; oldalszámozás a lap alján Betűtípus: Times New Roman; betűszín: fekete Főfejezet címe: 16 pt; félkövér Alfejezet címe: 14 pt; félkövér; (esetleges további alfejezet: pt; dőlt) Szöveg: 12 pt; sorkizárt Sorköz: 1,5 sor

14 Beadás Beadási határidő és formátum
A beadás határidő (éjfél). A kész tervezési feladatot PDF formátumban Czobor Ádámnak kell elküldeni ( ). Egyéb A feladatot önállóan kell megoldani! Más munkájának másolása, illetve régebbi tervezési feladatok felhasználása büntetést von maga után! A tervezési feladat során felhasznált irodalmi adatokat minden esetben hivatkozással kell ellátni. A felhasznált szekvenciák (nukleinsavak, fehérjék) link-jét mindig meg kell adni. A tervezési feladat során (elméletben) alkalmazott vegyszerek, enzimek, vektorok, kit-ek gyártóját és pontos nevét minden esetben meg kell adni, illetve az adott termék link-jét is be kell másolni a tervezési feladatba.

15 Köszönjük a figyelmet! E-mail címek: livius@mail.bme.hu