Polyacrylamid-Gél Elektroforézis (PAGE)

Az előadások a következő témára: "Polyacrylamid-Gél Elektroforézis (PAGE)"— Előadás másolata:

1 A GFP (Zölden Fluoreszkáló Fehérje) molekuláris tömegének meghatározása

2 Polyacrylamid-Gél Elektroforézis (PAGE)
A GFP (Zölden Fluoreszkáló Fehérje) molekuláris tömegének meghatározása 2

3 1. Vizsgálatok előkészítése a Polyacrylamid-Gel elektroforéziséhez (PAGE)
1. feladat: Ellenőrizd, hogy a P cső zölden fluoreszkál-e, ha UV-fénybe teszed.

4 1. A csövek előkészítése a PAGE-hez
1.1 Pipettázz 10 µl Lämmli puffert a csőbe (P). 1.2 Keverd össze a (P) csövet úgy, hogy „snipping”-eled.

5 2. A gél kazetták előkészítése
2.1 Nyisd ki a PAGE gél csomagot úgy, hogy elvágod a fekete vonal mentén, és vedd ki a Gél Kazettát.

6 2. A gél kazetták előkészítése
2.2 Vágd el a gél kazettát a kijelölt vonal mentén egy szikével (vagy egy borotvapengével) és húzd ki az alsó csíkot.

7 3. Az elektroforézis-kamra előkészítése
3.1 Tedd a gél kazettákat a rövidebb kábellel összekötött tányérral az elektróda állásba. A másik oldalhoz adj egy másik gélt vagy vak kazettát. 3.2 Helyezd az elektróda állást a szorítókeretbe és rögzítsd a szorítókat. 3.3 Tedd a szorítókeretet az elektróda állással a puffer tartályba. 3.4 Húzd ki a fésűt.

8 4. Töltsd meg a kamrát puffer-rel
4.1 Töltsd meg az elektróda állást TGS-puffer-rel a határig 4.2 Töltsd meg a puffer tartályt 200 ml TGS-Buffer-rel.

9 5. A gél „slot”-ok megtöltése
(bal és jobb „slot” üresen marad!) Töltsd meg a gél slot-okat az alábbiakkal: - 15 µl Kaleidoscope protein standard (K). - 15 µl a (P) csőből. Kaleidoscope protein standard Vizsgálat

10 6. Az elektroforézis vizsgálata
6.1 Zárd be a gél kamrát és indítsd el az elektroforézist 200V-on. 6.2 Hagyd abba az elektroforézist, amikor a Bromphenol kékje eléri a gél alsó végét.

11 7. A gél eltávolítása 7.1 Távolítsd el a szorítókeretet és öntsd a puffert a puffer-tartályba. 7.2 Távolítsd el a gél kazettákat.

12 8. Analízis 8.1 Jelöld meg a GFP csoportot az UV fényben

13 8. Analízis 8.2 Határozd meg a GFP molekuláris tömegét a standard kaleidoszkóppal! Szín kDa Kék 250 kDa Lila 150 kDa 100 kDa Madzsenta 75 kDa 50 kDa Zöld 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa Sárga 10 kDa Táblázat: A standard kaleidoszkóp molekuláris súlyai