A Förster féle energiatranszfer definíciója

Az előadások a következő témára: "A Förster féle energiatranszfer definíciója"— Előadás másolata:

1 Az elektron gerjesztési energia Förster-féle átadása; Biológiai alkalmazások

2 A Förster féle energiatranszfer definíciója
A Förster-féle energiatranszfer (FRET) során két (donor és akceptor) molekula között sugárzás nélküli energiaátadás történik. Az elmélet megalkotója Theodor Förster német fizikai kémikus. Szokás fluoreszcencia energiatranszfernek is nevezni, ennek rövidítése szintén FRET, de ez a megfogalmazás nem pontos, sőt, félrevezető, ugyanis a folyamat nem jár mindig fluoreszenciával. Az energiacsere lehetősége akkor áll fenn, ha az egyik molekula emissziós sávja átfedésben van a másik molekula abszorpciós sávjával. Az energiatranszfer tipikus távolsága 1-10 nm. Az energia átadásának hatásfoka nagyon erősen függ a távolságtól, ezért a módszert gyakran egy fehérjén belül, vagy fehérjék között a ligandumok távolságának meghatározására használják.

3 Theodor Förster 1910. május 15-én született, és május 20-án halt meg. Német fizikai kémikus Lipcsében és Provinzben tanult, később itt lett egyetemi professzor A göttingeni Max-Planck-Intézetben és a Stuttgarti Egyetemen is tanított.

4 A folyamat vázlata A folyamat során először az egyik molekula, szokásos elnevezés szerint a donor, egy fotont nyel el, ezáltal ez a molekula gerjesztett állapotba kerül. A gyors belső konverzió miatt a molekula gyorsan visszakerül alapállapotba, miközben az elektron gerjesztési energiát leadja. Ha a második molekula, a szokásos elnevezés szerint az akceptor, gerjesztési energia szintjei olyanok, hogy ezt az energiát képesek felvenni, akkor a gerjesztett állapot átadódhat erre a molekulára. Az akceptor ezután önmaga is visszakerül alapállapotba nem-sugárzó mechanizmusok segítségével, vagy pedig fluoreszcencia sugárzás kíséretében. Igen csekély annak a valószínűsége, hogy az akceptor a dezaktiválódás során visszaadja az elektron gerjesztési energiát a donornak. Ez a folyamat esetleg azonos donor-akceptor pároknál fordulhat elő.

5 A folyamat vázlata 2 Az energia átadás diagramja: kT D+A* D*+A k-T
Ahol kT a folyamat sebességi állandója A fent baloldalt látható az energia transzfer rezonancia sematikus ábrája. A jobb oldali kép ugyanazt a folyamatot szemlélteti a term-sémákon. Itt az akceptor és a donor különböző, az akceptor energianívója alacsonyabb, így a visszafelé történő energiatranszfer esélye elenyészően kicsi.

6 Förster elmélet A korábbiakban leírt szinglet-szinglet kölcsönhatásnak Theodor Förster adott kvantitatív magyarázatot, elmélete szerint az energia transzfer a két molekula közötti dipól-dipól kölcsönhatás segítségével történik. Az elmélet a 1-10 nm-es távolságok tartományán érvényes. Ennél nagyobb távolságokra az energia transzfer nem tud a dipól-dipól kölcsönhatásokon keresztül végbemenni. Kisebb távolságokon pedig már a mag elektromos tere is befolyásolja a kölcsönhatást. A folyamat nagyon erősen függ a távolságtól. A Förster által bevezetett formalizmus szerint a folyamat sebességi állandója: ahol D a donor életideje, ha nincs jelen akceptor, R a két csoport távolsága R0 pedig a Förster hossz (ennek a meghatározásával később foglalkozunk).

7 Förster távolság A Förster távolság szemléletesen az a távolság, amely távolságon a FRET hatásfoka 50%-os, vagyis amikor ugyanakkora a valószínűsége annak, hogy a donor egy foton kisugárzásával dezaktiválódik, mint annak, hogy energiáját átadja az akceptornak. Az R0 az alábbi képlettel határozható meg: ahol: J (átlapolási integrál) a spektrális átlapoltság mérőszáma (lásd később) n az akceptor és a donor közötti teret kitöltő közeg törésmutatója D a donor kvantumhatásfoka 2 (kappa négyzet) egy geometriai faktor, amit a donor és az akceptor egymáshoz képesti helyzetének a függvénye (lásd később)

8 J – átlapolási integrál
J a következő módon számolható ki: ahol:  a hullámhossz A az akceptor moláris extinkciós együtthatója fD pedig a donor normált fluoreszencia spektruma ahol FD a donor egységnyi hullámhossztartományra eső fluoreszencia intenzitása.

9 J – átlapolási integrál 2
Szemléletesen az átlapolási integrál a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektrumának a metszetét jelenti. A legfelső ábra a donor, a középső ábra az akceptor abszorpciós és emissziós spektrumát mutatja. A legalsó ábrán világoskék színnel az átlapolási integrál van besatírozva.

10 2 – kappa négyzet A 2 arányossági tényező vagy dipól orientációs faktor, a donor emissziós átmeneti momentumának és az akceptor abszorpciós átmeneti momentumának a függvénye. A következő képlettel lehet kiszámolni: ahol: T a donor emissziós átmeneti momentuma és az akceptor abszorpciós momentuma által bezárt szög D a donor emissziós átmeneti momentuma és a két molekulát összekötő vektor által bezárt szög A a akceptor abszorpciós átmeneti momentuma és a két molekulát összekötő vektor által bezárt szög A képlet alapján látszik, hogy 2 értéke 0 és 4 közé eshet. A gyakorlatban, mivel a szögértékek csak ritkán ismertek, 2-et gyakran 2/3-nak veszik, amely közelítés elsősorban oldatban teljesül jól.

11 A Förster elmélet bizonyítása
Az elméletet először a következő kísérlettel sikerült bizonyítani. Egy akceptor-donor párt, nevezetesen a Dansyl-t és a Naphtyl-t, olyan molekulába építették be, melyben a két centrumot különböző hosszúságú lánc választotta el egymástól: Dansyl – (Pro)n – NH – CO – NH – Naphtyl A prolin aminosavak II típusú hélixet alkotnak, mivel ennek a hélixnek a hossza csak a prolin molekulák számától függ, ezért a naphtyl donor és a dansyl akceptor távolsága pontosan ismert. Az ezekből a távolságból számolt fluoreszencia hatásfok jó egyezést mutatott a mért értékekkel. A kísérletet más molekulákkal megismételve is hasonló eredményt kaptak. Tehát az elmélet valóban jó közelítést ad a jelenségre.

12 A FRET használata a biológiában
Távolság mérésre (spektroszkópiai vonalzó) Távolság változásának mérése Akceptor és donor photobleaching (fénykifakítás) Fluoreszencia korrelációs spektroszkópia Emissziós „újlenyomat” készítése

13 Távolságmérés A távolság mérés lehetséges felhasználásai:
inter- és intramolekuláris távolságok meghatározása molekulák közti asszociáció kimutatása molekulaszerkezet, konformáció vizsgálata. A távolságot minden esetben intenzitás értékekkel lehet jellemezni, mégpedig a következőképen: Az elektron gerjesztési energia átadásának hatásfoka az alábbi képlet alapján számolható: ahol: kT a transzfer sebesség kF, kIC és kIS az egyéb dezaktivációs folyamatok sebességi állandói

14 Távolságmérés 2 A FRET hatásfok kísérletileg meghatározható
- a donornak akceptorral és akceptor nélkül mért fluoreszcencia intenzitásaiból: E = 1 – Fda / Fd - a donor gerjesztett állapot élettartamának csökkenéséből: E = 1 - da/d - a donor fluoreszencia anizotrópia növekedéséből. E = 1 – (r0/rda-1)(r0/rd-1) - valamint az akceptornak donorral és anélkül mért floureszencia intenzitásaiból (ez bonyolultabb összefüggés).

15 Távolságmérés 3 Az energiaátadás hatékonysága a donor és az akceptor között: Az ábra egy példát mutat be az energia transzfer távolság függésére. Mivel a képletben a távolság hatodik hatványa szerepel, ezért ezzel a módszerrel csak 0,5 és 1,5 R0 közti távolságokat lehet mérni. Ez alatt illetve e felett az egységnyi távolság növekedésre vagy csökkenésre jutó intenzitás változás olyan minimális, hogy lehetetlen detektálni.

16 Távolságmérés 4 A távolságmérés alapulhat intrinsic (belső) fluoreszcencián (ilyenkor a fehérje vagy egyéb szerkezet részét képzi a donor és az akceptor), ill. lehetnek ezek kívülről a molekula megadott helyére kapcsolt molekulák. Intrinsic fluoresszencia Fluoreszcens aminosavaknál (triptofánnál, tirozinnál, fenilalaninnál) alkalmazható. Előnye, hogy nem kell jelölő molekulákat a rendszerhez adni, így a fehérjét természetes állapotában vizsgálhatjuk, illetve, hogy így pontosan tudjuk, hogy egy fehérjén belül hány darab potenciális akceptor és donor van. Hátránya, hogy viszonylag kicsi a kvantumhatásfoka. Az oldószer függvényében változhat a fehérje konformációja, ami megváltoztatja a csoportok közti távolságot.

17 Távolságmérés 5 A fehérjéhez kapcsolt donor és akceptor
Előnye az igen jó kvantumhatásfok. Előnye, hogy olyan helyekre is lehet jelölő molekulákat kapcsolni, ahol nem fluoreszkáló aminosavak vannak, így nem lehetne a távolságot belső fluoreszenciával mérni. Ez azonban az egyik nehézsége is a módszernek, mert egyes esetekben nehéz lehet olyan jelzőmolekulát találni, ami a kívánt helyre kötődik. Hátrány, hogy a fluorofor véges nagyságú, így mérete hozzáadódhat a mért távolságokhoz Legnagyobb nehézség ebben a módszerben annak a biztosítása, hogy ne kötődjön több akceptor és donor ugyanarra a fehérjére. Ideális esetben egy flourofor kötődik egy fehérjéhez, ha ennél több kötődik egy fehérjéhez, akkor nincs lehetőség pontos távolság, csak távolság változás mérésére.

18 Távolságmérés 6 – Donor-Akceptor párok
Néhány tipikus távolságmérésre használt donor-akceptor pár: Legnépszerűbb pár a CFP-YFP pár (cyan and yellow flourescence protein), mindkettő a GFP (green flourescence protein) egy variánsa. Ezek előnye, a fenti molekulákkal szemben az, hogy nincs szükség hosszadalmas előkészítésre, hogy a fehérjéhez kapcsolhassuk őket, hanem megfelelő genetikai módosításokkal a fehérjét úgy alakíthatjuk ki, hogy már létrejöttekor tartalmazza ezeket a fehérjéket. Donor Akceptor R0 [Å] BODIPY FL 57 Fluorescein Tetramethylrhodamine 55 IADANS 46 44 EDANS DABCYL 33

19 Távolságmérés 7 - Példa

20 Távolság változásának mérése
A távolság változás mérésnek a elmélet igen hasonló a távolság mérés elméletéhez. Itt azonban nem a floreszcencia intenzitását, hanem annak változását mérjük. Ezzel a méréssel akár 1-2 Å-ös távolságváltozások is detektálhatók. Ezzel a módszerrel nagy pontossággal vizsgálhatóak a fehérjék konformáció változásai.

21 Akceptor és donor photobleaching
Akceptor photobleaching, a mérés menete: Egy FRET felvételt készítünk a mintáról. Az akceptort fénnyel kifakítjuk, vagyis hosszabb ideig sugározzuk be az abszorpciós hullámhosszán. Ezután újabb FRET felvételt készítünk. A második felvétel elvileg már csak nem vagy alig tartalmaz akceptort, így a FRET mérés során a második mérés már csak a donor saját floureszcenciáját tartalmazza, mivel a FRET során pont ez az a sugárzás amire nincs szükségünk, a mérésben zajként jelentkezik, ezért ezt egyszerűen kivonva az előző intenzitásból megkapjuk azt a sugárzás intenzitást, amit a donor csak a energiatranszfer miatt sugároz. Innen kiszámolható az energiatranszfer hatásfoka: E = 1 – I0d+a/I0(d+a)-a

22 Akceptor és donor photobleaching 2
A – donor eredeti B – donor a photobleaching után C – akceptor eredeti D – akceptor a felső fél photobleaching-je után (az alsó fél a referencia) E – A FRET hatásfok térképe: a felső fél átlaga 0,3 körül van (lásd grafikon), az alsó félé, amint azt vártuk, 0 körül van.

23 Akceptor és donor photobleaching 3
Donor photobleaching, a mérés menete: Kell egy minta, amely mindkét csoportot, és egy, ami csak a donort tartalmazza Donorról képek sorozata az idő függvényében Exponenciális illesztés a donor képsorra, a kiégési időállandó (bl) meghatározása Ft = A * exp(-t/ bl)+b A mindkét csoportot és a csak a donort tartalmazó minták időállandóiból a FRET hatásfok meghatározható E = 1 - <bld>/bld+a

24 Akceptor és donor photobleaching 4
Egy példa a donor fotóelhalványításra:

25 Emissziós „ujjlenyomat” készítése
Az YC2 fehérje és FRET analízis segítségével lehetőség van a sejten belül a Ca2+ szint feltérképezésére. Az YC2 a sárga flourecszens fehérje (YFP) a cián floureszcens fehérje (CFP) és a calmodulin fúziójából létrejövő fehérje. Működésének alapja, hogy ha nincs jelen Ca2+, akkor az YFP és a CFP a molekula két végén helyezkedik el, túl messze egymástól ahhoz, hogy a FRET módszerrel fluoreszenciát detektáljunk. Ca2+ jelenlétében a molekula konformációja megváltozik, a két fehérje olyan közel kerül egymáshoz, hogy FRET-et figyelhetünk meg.

26 Emissziós „ujjlenyomat” készítése 2
A módszer segítségével 4 dimenziós képet lehet készítni a mintáról, a mikroszkóp látómező két dimenzióját kiegészítjük a harmadik dimenzióval, amit különböző rétegekben felvett képekkel tehetünk meg, a negyedik dimenzió pedig az idő.

27 Emissziós „ujjlenyomat” készítése 3
A képek elemzése segítségével kiszámolható a YFP és a CFP közötti spektrális eltolódás. Ha ezt az eltolódást idő szerint ábrázoljuk, akkor egyértelműen látszik a stimulus ideje, ami a Ca2+ felszabadulást előidézte.

28 Legújabb kutatások a FRET-tel
1995 – Kam et al – A citoszkeleton 4 fehérjéjének egymáshoz képesti viszonyát térképezte fel. 1995 – Tsien és Mitra et al– Az első aki GFP és a CFP közti FRET-et kimutatta. 1998 – Gordon et al – Egy több filteres FRET képfeldolgozási eljárást dolgozott ki. 2001 – Xia és Liu – Egy Gordonéhoz hasonló, három filteres eljárást dolgoztak ki. 2002 – Hopp, Swanson et al – A FRET hatásfok elemzésének új módszerét dolgozták ki, melyhez egy alap és időben több képet vettek fel. 1998 – Periasamy és Day – a 3 dimenziós módszeren dolgoztak. 1998 – Suzuki et al – A myozin fejének mozgását vizsgálták FRET analízis segítségével. 1998 – Zolkarnik et al – Az autofluoreszcencia vizsgálati módszerein dolgoztak

29 BRET A FRET módszer hátránya, hogy fluoroforokkal dolgozunk, hogy külső megvilágítás kell ahhoz, hogy energiatranszfert indukáljunk. Ez háttérzaj megjelenéséhez vezet. Ennek elkerülésére dolgozták ki a Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) módszert. Ez a módszer biolumineszcenciát használ a belső foton emisszió létrehozásához. Legáltalánosabban luciferázt használnak erre a célra.

30 Források Wikipedia – FRET bejegyzés – www.wikipedia.org
Emission Fringerprints and FRET – AxioVision FRET termékleírás – Bodnár Andrea PhD dolgozat – 2002, Debrecen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) as a Probe of Proximity in Proteins – Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Imaging –