1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete

Az előadások a következő témára: "1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete"— Előadás másolata:

1 1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete
2011. február

2 "High-Efficiency Particulate Air"
Steril munka-fülkék „Glove box” Class III steril box a fülkében lévő anyag védelme a külső szennyeződéstől Biosafety Cabinets (BSCs) / biztonsági fokozat (BSL) az anyaggal dolgozók és a külső tér védelme a fülkében levő szennyezőktől (Class I) a fülkében levő anyag és a külső tér kombinált védelme (Class II) szűréssel a környezet fokozott védelme az „elhasznált” levegő zárt csőben való elvezetésével és a kikerülő anyag helyben sterilizálásával (Class III ; BSL-4 nagyon veszélyes anyagokkal végzett munkához) HEPA filter "High-Efficiency Particulate Air"

3 Termosztátok Mikroszkópok Hőmérséklet-stabilizálás: víz-köpeny
levegő-köpeny Hűteni is tud! Gáztér összetétel CO2 / N2 palackról; levegő páratartalom: víztartály ; buborékoltatás áramoltatás (ventillátor; speciális oldal/ajtó fűtés→konvekciós keverés HEPA filter; 0,3 mm Légtér-szűrés Mikroszkópok Inverz optikai rendszerek az élő kultúrák monitorozására

4 Sterilizálás – felületek: lemosás, steril légtér
Steril munkahely Sterilizálás – felületek: lemosás, steril légtér - eszközök: nagy-nyomású (1,2-1,3 bar) vízgőz (autokláv) száraz hő (Hő-lég sterilizátor; 180 – 240 Co gáz (pl. polietilén-glikol) gamma-besugárzás láng (égetés) alkohol - oldatok : nagy-nyomású (1,2-1,3 bar) vízgőz (120 oC) (autokláv) mikrohullám antibiotikumok, gombaölőszerek, citotoxikus vegyületek steril szűrés Steril környezet – helyiség: túlnyomás, külső levegővel való keveredés minimalizálása speciális takarítás, belépési feltételek - ruházat: szájmaszk, lábzsák stb Steril munkavégzés – kézfertőtlenítés, eszköz fertőtlenítés, lefedés, folyadék és hulladék kezelés Egyszerű asztali autoklávok

5 „Fiziológiás sóoldat” : 0,15 M NaCl = 300 mOsm = 150 mekv Na+ + 150 mekv Cl-
CO2 a levegőben: 0,039tf% A teljes gázP ~ 5%-a „Foszfát pufferelt fizsó” (phosphate buffered saline; PBS): pH stabilizálás, CO2/HCO3-, HEPES (10mM) Tyrode-oldat: glukóz

6 Tápoldatok Ozmotikus viszonyok: telített vízgőz-atmoszféra
kolloid-ozmotikus nyomás ozmometer Ion-összetétel (emlősök szöveti sejtjei!) Na+ / K+ : 150 / 5 mekv (mmol/l) Ca2+: 1,2-3,6 mmol/l anionok Puffer-kapacitás: CO2 (!), HEPES pH ~ 6,8-7,3 Modern variációk: Earle, Hank, Eagle, Dulbecco sóoldatok: (szervetlen kiegészítők: Ca2+, Mn2+, Mg2+, Se, stb) minden medium „alapja” Tápanyag Glukóz (1000 g/l – 4500 g/l Aminosavak: esszenciális /nem-esszenciális koncentrátumok; „nutriens médiumok” (F-10,F-12), Piruvát, zsírsavak Hormon, vitamin kiegészítők

7

8 Biológiai kiegészítők
Sejttípus, sejtállapot- és sejtsűrűség függő igények: hormonok, vitaminok, cyto- és chemokinek, növekedési (mitogén és differenciációt okozó) faktorok Szérum, szövetkivonat, kondicionált médium – ismeretlen összetételű bio-additívumok Heterogén, nem azonosítható bioaktív komponensek – növekedési faktorok, cytokinek, szteroid és peptid-hormonok, enzimek, adhéziós molekulák, stb Fötális, újszülött és felnőtt, illetve kb fajokból származó szérumok nem azonosak! Minden gyártmány-széria különböző lehet „Definiált” médiumok: Szérum-mentes Fehérje-mentes Kémiailag definiált pl.: N2 médium : insulin ( 5 mg/ml), transzferrin (100 mg/ml), szelén ( 30 nM), progeszteron ( 20 nM), T ( 2) nM, Putreszcin (100 mM) „Definiált” kiegészítők ITS, B27 (RA+/-), „Serum Replacement” (Bottenstein, Sato 1979)

9

10 Jellegzetes családtag
(Szuper-)család Jellegzetes családtag Receptor-típus Citokin családok CSF, EPO, CNTF, LIF, IL1-22, TNF-család Sok féle……. EGF EGF, Neuregulin Trk FGF (lásd külön tábla) NGF Trk, p75 PDGF PDGF, VEGF TGF Ser/Tyr kinázok Insulin IGF-1,2, Cys-knot = cisztein-csomó NGF, TGF-beta, PDGF-B, HCG.

11 TGF szuper-család GDNF (Glial Derived Neurotrophic Factor) TGFb
(Transforming Growth Factor) DVR* (Decapentaplegic/Vegetal-1 Related) Activin távoli családtagok TGFb-1/-4,-5(X) TGFb -2 TGFb -3 BMP-2, BMP-4, BMP-3,-3b BMP-5,-6,-7 BMP-8, -8b BMP-10 BMP-11 BMP-15 Activin (D) Daf-7 (C) Unc-129 (C) Neurturin Inhibin-bA-E Artemin GDF-15/Mic-1 Persephin MIS Inhibin-a Ebaf/Lefty GDF-1 GDF-3 GDF-5-7 GDF-8 Xnr-1-3 ADMP (X) Vg1 (X) 60A Dpp Screw LATENT TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA BINDING PROTEIN ! – lokalizáció/aktiválás

12 FGF-család Heparán-kötő faktor! – lokalizáció, aktiválás; Család-tag
Más elnevezés előfordulás Szignál szekv NLS FGF-1 Savas FGF (aFGF) Xenopus ---- Human - + FGF-2 Bázikus FGF (bFGF) FGF-3 INT-2 FGF-4 HST-1, K-FGF (Kaposi) FGF-5 Rágcsálók ---- Human FGF-6 HST-2 FGF-7 KGF (keratinocita GF) emlősök FGF-8 AIGF (androgen induced GF) FGF-9 GGF (glial GF) FGF-10 FGF-11 FHF-3 FGF-12 FHF-1 Csirke --- Human FGF-13 FHF-2 FGF-14 FHF-4 FGF-15 egér EGL-17 C.elegans BNL Branchless Drosophila Intracelluláris hatások Heparán-kötő faktor! – lokalizáció, aktiválás;

13 EGF család CX7CX4-5CX10-13CXCX8GXRC 3 intramolekuláris S-S híd
Család-tag Más elnevezés Előfordulás/szerep HB-EGF Heparin-binding EGF-like growth factor Sebgyógyulás, szív-fejlődés TGF-α transforming growth factor-α Makrofág, felnőtt agy regeneráció AR Amphiregulin keratinocita EPR Epiregulin Epigen BTC Betacellulin NRG1 neuregulin-1 akternative splicing: 6 variáns: I-VI NRG1 I-NRG1: Heregulin, NDF, ARIA II-NRG1: Glial Growth Factor 2 GGF2 III-NRG1: Sensory/motor neuron-derived factor SMDF IV-VI-NRG1: ? (eltérő N-terminális szekv.) NRG2 neuregulin-2 CNS NRG3 neuregulin-3 NRG4 neuregulin-4 EGFR: receptor tyrosine kinases: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) Her 4 (ErbB-4)

14 az NT-4 emlős megfelelője
Neurotrofinok Neurotrofin előfordulás TRK receptorok: Trk a,b,c p75 NGF minden gerincesben BDNF NT-3 NT-4 Xenopus, csirke NT-5 az NT-4 emlős megfelelője NT-6 Csontos halakban Szimpatikus ggl. Háti érző dúc