ELISA gyakorlati menete Gyakorlat, amivel bizonyíthatjuk a HIV fertőzést anti-HIV antitestek bizonyítéka a vérben.

Az előadások a következő témára: "ELISA gyakorlati menete Gyakorlat, amivel bizonyíthatjuk a HIV fertőzést anti-HIV antitestek bizonyítéka a vérben."— Előadás másolata:

1 ELISA gyakorlati menete Gyakorlat, amivel bizonyíthatjuk a HIV fertőzést anti-HIV antitestek bizonyítéka a vérben

2 Tanári előkészületek

3 Mosó puffer (900 ml) 805 ml H 2 O dest. + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 a mosó puffer az antitest oldat hígításához és a mikrotitráló tányér mosásához szükséges Tween 20 BSA tartalmaz, ami gátolja a szabad szilárd szakasz felszínét 1. Puffer oldatok előkészítése PBS-puffer (100 ml) 90 ml H 2 O dest. + 10 ml PBS (10x) PBS-puffer szükséges a hidrofil antigének és antitestek re-hidratálásához.

4 2. Rehidratáció pipettázzon 0,5 ml hígított PSB-puffert az antigénbe és az első és másodrendű antitestbe! Az alapanyag oldatok ötvenszeresen koncentráltak! nyissa ki a az antitest dugaszt és az antigén edényeket! zárja le az edényeket a dugasszal és rázza őket kb. 2 percig (alapanyag oldat ) !

5 3. Címkézés Címke két polietilén üveggel: - antigén - elsőrendű antitest - másodrendű antitest Antigen

6 Diák előkészületek 8 csapat A vegyszerek 3 folyamatra elegendőek a 8 csapatnak! (3 x 160 µl stock oldat = 480 µl; 500 µl (total volume)

7 Kémcsövek áttekintése Kémcső színe címketartalommennyiség zöld“AG“antigén800 µl narancs“sAB“Enzimmel kötött másodrendű antitest 800 µl barna“SUB“szubsztrát800 µl lila“pAB“Elsőrendű antitest120 µl kék“WB“Mosó puffer120 µl citromsárga - Még üres!

8 1. Minták (P1 – P8) előkészítése -címkézze meg a 8 citromsárga kémcsőt a csoportszámokkal! -pipettázzon 60 µl elsőrendő antitest oldatot (pAB, pozitív teszteredmény) vagy 60 µl mosó puffert (WB, negatív teszteredménynél) mind a 8kémcsőbe. Írja le a szerkezetüket! (P1 – P8 a szérumminták)! -Osszon minden csapatnak 1 kémcsőt! !

9 Kémcsövek komplett áttekintése (teszt kezdése) Kémcső szín címketartalommennyiség Zöld“AG“antigén800 µl naranc s “sAB“secundary enzyme linked antibody 800 µl barna“SUB“subsztrát800 µl lila“pAB“elsőrendű antitest120 µl kék“WB“Elsőrendű puffer120 µl citromP1-P8“vér szérum” minta 1-860 µl each

10 2. Végrehajtás

11 2.1 Antigén megkötés mikrotitráló tányéron -Címkézze meg a mikrotitráló tányért a következő kép szerint! - pipettázzon 50 µl antigén oldatot (AG, zöld kémcső) mind a 12 kutacskába! - Inkubálja 5 percig! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

12 Antitest ellenőrzés alapelv Antigének szilárd fázishoz kötődnek

13 2.2 Mikrotitráló tányér mosása vágja be a tányért zsebkendőn! pipettázzon 250 µl mosó puffer minden kútba! figyelem! Pipettázás közben ne fröccsenjen ki a mosó puffer más kutakba! vágjon be tányérokat új zsepin!

14 Antigének szilárd fázishoz kötődnek a nem formálható felszín blokkolva van Antitest ellenőrzés alapelv

15 pozitív kontroll: pipettázzon 50 µl elsőrendű antitestet(pAB, lila kémcső) 2 “ + ” –al jelölt kútba! 2.3 Kontroll és minta előkészületek negatív kontroll: pipettázzon 50 µl mosó puffert (WB, kék kémcső) 2 “ - ” –al jelölt kútba! pAb WB + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

16 2.3 Kontroll és minta előkészületek inkubálja 5 percig! minták 1-8: pipettázzon 50 µl-t „tesztszemély szérummintájából“ P1 – P8 a 8 megfelelő kútba! Minden kúthoz használjon külön véget ! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

17 Antitest ellenőrzés alapelv antigens bind to solid phase a nem formálható felszín blokkolva van adjon hozzá szérumot, hogy tesztejük az antitestek viselkedését

18 2.4Mikrotitráló tányér mosása (lsd. 2.2 ) üres+ 250 µl WBüres

19 2.5 Másodrendű antitestek hozzáadáa inkubálja 5 percig! pipettázzon 50 µl másodrendű antitest oldatot(sAB, narancs kémcső) mind a 12 kútba!

20 Antitest ellenőrzés alapelv Antigének szilárd fázishoz kötődnek a nem formálható felszín blokkolva van adjon hozzá szérumot, hogy tesztejük az antitestek viselkedését enzimmel összekötött antitestek az aktuális antitestek epitópjával összekapcsolósnak

21 üres+ 250 µl WBüres 2.6 Kétszer mossa meg a mikrotitráló tányért (lsd. 2.2 )

22 2.7 Szubsztrát hozzáadása inkubálja 5 percig! pipettázzon 50 µl szubsztrát oldatot (SUB, barna kémcső) mmind a 12 kútba!

23 Antitest ellenőrzés alapelv Antigének szilárd fázishoz kötődnek a nem formálható felszín blokkolva van adjon hozzá szérumot, hogy tesztejük az antitestek viselkedését enzimmel összekötött antitestek az aktuális antitestek epitópjával összekapcsolósnak Fertőzés bizonyítása enzimatikus reakció által

24 3. Értékelés A pozitív minták kék színűek, a negatívok színtelenek maradnak(kontrol) Ellenőrizze a teszteredményeket (P1 – P8) csoportban! + + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 pl.: