Gombafertőzések laboratóriumi diagnosztikája dr. Mestyán Gyula 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE.

Az előadások a következő témára: "Gombafertőzések laboratóriumi diagnosztikája dr. Mestyán Gyula 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE."— Előadás másolata:

1 Gombafertőzések laboratóriumi diagnosztikája dr. Mestyán Gyula 2015 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

2 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tartalomjegyzék A gombák egyes lényeges tulajdonságai Laboratóriumi diagnosztika Preanalitikai fázis Vizsgálati minták vétele, tárolása, szállítása Analitikai fázis Közvetlen kimutatás mintából Direkt mikroszkópos vizsgálat Direkt antigén vizsgálat Tenyésztés Identifikálás Prezumptív identifikálás Definitív identifikálás Szerológia Antimikotikum érzékenységi vizsgálatok

3 A gombák lényeges tulajdonságai AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

4 Gombák Eukaryóták Lassan növő, heterotróf, aerob organizmusok A diagnosztikát és terápiát segítő felszíni tulajdonságaik Sejtmembrán: ergoszterol Sejtfal: kitin, glukán, mannán Morfológiájuk, életvitelük, pathogenitásuk alapján csoportosíthatóak Lehetnek sarjadzó gombák, fonalas gombák és dimorf gombák Lehetnek szaprofiták, kommenzálisok és pathogének Lehetnek opportunista és nem-opportunista kórokozók A candidák a felső légútak, a gasztrointesztinális traktus, a hüvely, a bőr normál flórájához tartoznak Feloszthatjuk őket az általuk okozott fertőző betegségek alapján is AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

5 Reproduktív életciklusok (spóraképzés módja) Aszexuális – „Anamorf” Diagnosztikai laboratóriumban ezt az állapotot látjuk legtöbbször Szexuális – „Teleomorf” Vegetatív életszakasz AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A gombák életciklusai

6 Aszexuális szaporodás Mitózis Sokmagvú óriássejt Sejtosztódás „Conidium” (egy új sejt / egy új klón) Blastoconidium Sarjadzás Chlamydoconidium „ Sporuláció” Arthroconidium Hifák fragmentációja „Conidium” Spóratartó képleten Sporangioconidium Spóratartó képletben http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/mediahttp://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/mediaFile:Candida_albicans_2.j pg http://en.wikipedia.org/wiki/Coccidioides_immitis#/media/File:Arthroconidia_of _Coccidioides_immitis_39G0040_lores.jpg http://en.wikipedia.org/wiki/Penicillium#/media/File:Penicillium_Spp..jpg http://en.wikipedia.org/wiki/Sporangium#/media/File:Mature_sporangium_of_a_Mucor_sp._fungus.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Aszexuális spórák = Conidiumok

7 Hypha Átmérő: 2 -10  m Szeptált vagy nem-szeptált Növekedés Apikálisan (csúcsnövekedés) Elágazódással http://www.medical-labs.net/fungi-hyphae-1522/non-septate-hyphae-coenocytic-hyphae Szeptumok nem láthatóak AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fonalas gombák http://www.medical-labs.net/fungi-hyphae-1522/non-septate-hyphae-coenocytic-hyphae

8 http://en.wikipedia.org/wiki/Zygomycota#/media/File:Zygomycetes_on_solid_media..png Mycelium: Hyphák szövedéke Gombatelep (thalus) Lég- és vegetatív mycelium Légmycelium Vegetatív mycelium Agar felszín AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fonalas gombák

9 Alak Kerek vagy ovális Méret 3 - 5 μm Pszeudohyphák Telepek Baktériumtelepekhez hasonlatosak Légmycéliumot nem fejlesztenek http://www.asm.org/division/c/ redesign/images/imagelib/photo/calb1.jpg http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Candida_albicans_(257_12).jpg https://www.flickr.com/photos/microbeworld/sets/72157625392265538/detail AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gombák Sarjadzó sejtekSarjadzó sejtek és pszeudohyphák

10 Kétféle morfológiai állapot 1.Többsejtű / fonalas gomba „Környezeti állapot” 2. Egysejtű / sarjadzó gomba „Szöveti állapot ” Példa: Histoplasma capsulatum Talajban vagy 25 0 C-on tenyésztve Gazdaszervezetben vagy 37 0 C-on tenyésztve http://pixshark.com/histoplasm-capsulatum-map.htm AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Dimorf gombák http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Histoplasmosis%285414173501%29.jpg

11 Sarjadzó gombaFonalas gombaDimorf gomba Candida spp.Aspergillus spp.Malassezia furfurPneumocystis jirovecii Cryptococcus neoformansRhizopus spp.Microsporum spp. Mucor spp.Trichophyton spp. Epidermophyton spp. Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Penicillium marneffei AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A gombainfekciók fontosabb kórokozói

12 I. A bőr gombafertőzései Szuperficiális mikózisok Pytiriasis versicolor: Malassezia furfur Dermatophytosisok Dermatophyton fajok által okozott bőr-, hajszál-, körömfertőzések: Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton floccosum Dermatomycosisok Nem dermatophytonok által okozott bőr fertőzések: pl. Candida spp. Szubkután gombafertőzések pl. sporotrichosis: Sporothrix schenckii II. Endémiásan előforduló gombafertőzések Nem-opportunista, dimorf gombák fertőzései: pl. Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis III. Opportunista gombafertőzések Immunológiailag nem kompetens betegek invázív fertőzései: Invázív (és lokális) aspergillosis, mucormycosis: Aspergillus spp. / Mucor spp. Cryptococcosis: Cryptococcus neoformans Invázív candidasis (és mukokután): Candida spp. Pneumocystis jirovecii http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HumanSkinDiagram.jp AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A gombák csoportosítása

13 Laboratóriumi diagnosztika AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

14 Preanalitikai fázis Vizsgálati minták vétele, tárolása, szállítása Analitikai fázis Közvetlen kimutatás mintából Direkt mikroszkópos vizsgálat Direkt antigén vizsgálat Tenyésztés Identifikálás Prezumptív identifikálás Definitív identifikálás Szerológia Antimikotikum érzékenységi vizsgálat AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Diagnosztika I.

15 A gombafertőzés diagnosztikájának felelősségi körei: Klinikus Klinikai diagnózis Vizsgálati minták vétele, tárolása és szállítása Hisztopatológus Gomba kimutatás szövetmintából Klinikai mikrobiológus (mikológus) Mikroszkópos vizsgálat, direkt antigén kimutatás, direkt molekuláris vizsgálat, tenyésztés, identifikálás, antimikotikum érzékenységi vizsgálat, szerológia AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Diagnosztika II.

16 Preanalitikai fázis: Vizsgálati minták vétele, tárolása, szállítása AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

17 Az eredményes laboratóriumi vizsgálat preanalitikai alapjai: a korrekt diagnózis és a szakma szabályai szerint vett, tárolt és szállított minta Egyes fertőzések kórokozói a klinikai kép alapján is valószínűsíthetőek A kórokozó pontos meghatározása ilyenkor is fontos, pl. mukokután candidiasist okozó fajok antimikotikum érzékenysége különböző lehet Vizsgálatkérő lap Tartalmazzon minden fontos klinikai és epidemiológiai információt! Ezek segítik a vizsgálatok tervezését és eredményeinek interpretálását: utazás, lakhely, foglalkozás, szabadidő tevékenység, állati kontaktus, fertőzésre hajlamosító alapbetegségek, … AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Mintavétel, tárolás, szállítás

18 Steril testtájról és A.) A steril testtájak gombafertőzései A mintavételi ajánlások nem térnek el a baktériumok által okozott fertőzéseknél előírtaktól Genny, szövetminta Aspirátum jobb, mint a vattapálcával vett minta Szövetdarabot az elváltozás közepéből és széli részéből is ajánlott venni Tályog: genny és minta a tályogfalból B.) Nem-steril testtájak fertőzései - b őr, haj, köröm minták A mintavételi ajánlások eltérőek lehetnek Mintavételt megelőző előkészítés: tisztítás 70% alkohollal bakteriális kontamináció kockázata ↓ Bőr: elváltozás gyulladt széli részéről tompa szikével, tárgylemez szélével, vagy Cellux-szalaggal vett minta tárgylemezen elküldve Hajszál: nem vágni, kihúzni ajánlott / 10-12 elegendő / steril tartályban, borítékban küldve Ultraibolya lámpa segítheti a kiválasztást Sterilizálható, masszírozó lap használata könnyítheti a fertőzött hajszálak gyűjtését Köröm: egy darabja, annak teljes vastagságában, vagy mély kaparék AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Mintavétel / I.

19 B.) Nem-steril testtájról vett minták (folytatás) Nyálkahártya: Kaparék jobb mint a vattapálcával vett minta Hüvely: Klinikai kép és festés elegendő Tenyésztés: ha nem tudunk festeni, vagy sikertelen kezelés esetén Vizelet: A mintavétel során a minta ne kontaminálódjon a hüvely - és a perineális flórával (candidák!) Disszeminált histoplasmosisban, coccidioidosisben a kórokozók vizeletből esetleg kitenyészthetőek Alsó légúti minták Köpet: 3x kora reggeli első minta, szeparáltan (nem gyűjtve!) küldve Immunkompromittált állapotok: BAL, perkután tűbiopszia Széklet: Ha invazív fertőzés gyanítható: kolonoszkópia + szövetminta vétele ajánlott! A széklet tenyésztést vissza kell utasítani - a candidák a normál flórához tartoznak ! Bármi megbontja a mikrobiota egyensúlyát a candidákat nagy számban tenyészthetjük AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Mintavétel / II.

20 Szállítás A mintákat, egyes esetektől (pl. dermatophytosisok) eltekintve, steril edényben, haladéktalanul kell a laboratóriumba szállítani: < 2 óra A késedelmes transzport a kórokozó elpusztulásához vagy A kontamináló baktériumok elszaporodásához vezethet Tárolás Kényszerű tárolás körülményei: Steril testtájról származó, mélyszöveti minta: szobahőn Felületi minta: 4 0 C Dermatophytosisok A mintákat nem feltétlenül kell steril edényben tárolni és szállítani A clean envelope can be suitable / as the specimen dries out during storage and transportation, thus the contaminating bacteria cannot multiply Tárolás során ne hűtsük a mintát! A dermatophytonok érzékenyek az alacsony hőmérsékletre AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Mintatárolás és mintaszállítás

21 Közvetlen kimutatás mintából AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

22 Mikroszkópos vizsgálat Antigén kimutatás Molekuláris vizsgálatok Hibridizáció Amplifikáció AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Gombák közvetlen kimutatása mintából

23 A minták direkt mikroszkópos vizsgálata Natív készítmény vagy fixált kenet megtekintése Gyors és költséghatékony < 1 óra ( ↔ tenyésztés: több nap, több hét) De: szenzitivitása alacsony Sarjadzó - és fonalas gomba elkülönítése lehetséges Eredménye segíti a tenyésztés és az empírikus antifungális terápia tervezését és a tenyésztési eredmények interpretálását: Izolátum szignifikanciája? Normál flóra tag (pl. Candida spp.)? Környezeti gomba (pl. Aspergillus spp.)? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / I.

24 Meghatározható az infekció típusa: blastoconidiumok, pszeudohyphák candidiasis szeptált hyphák, elágazódások / 45 0 aspergillosis nem-szeptált hyphák, elágazódások / 90 0 mucormycosis bőr, köröm, haj: hyphák, arthroconidiumok dermatophytosis http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3199404_ad-23-S11-g002&req=4 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Zygomycosis,_mucormycosis_2.jpg http://www.asm.org/division/c/redesign/images/imagelib/photo/cab1.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / II.

25 Genus vagy species szintű diagnózishoz juthatunk Liquor / tokos, sarjadzó sejtek Cryptococcus neoformans Cysta Pneumocystis jirovecii Intracelluláris sarjadzó sejtek Histoplasma capsulatum Vastagfalú sphaerula endosporákkal Coccidioides immitis commons.wikimedia.org/wiki/File:Cryptococcus_neoformans_using_a_light_India_ink_staining_preparation_PHIL_3771_lores.jpg http://static.wikidoc.org/f/f7/Pneumocystis_jirovecii.jpg http://library.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/AIDS/AIDS041.html http://www.publicdomainfiles.com/show_file.php?id=13489018816349 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / III.

26 Eredményközlés Bőr és bőrfüggelékek fertőzései A terápia indítása gyakran a mikroszkópos eredmény alapján történik A dermatophytonok tenyésztési ideje hosszú Az indításhoz elegendő a hyphák és arthroconidiumok jelenléte Haj fertőzése: ectothrix / endothrix növekedés elkülönítése fontos A növekedés típusa utalhat a dermatophyton fajra Sarjadzó gombák, pszeudohífák detektálása szignifikáns lelet lehet AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / IV.

27 Eredményközlés (folytatás) Légúti minták: köpet, BAL Gomba mycelium a kenetben: Kolonizáció? Invazív fonalas gomba fertőzés? Gyors eredményközlés és konzultáció szükséges Különösen, ha a beteg immunkompromittált ( invázív aspergillózis?) Sarjadzó gomba +/- pszeudohypha a kenetben Oropharyngeális kolonizációra utalhat Sarjadzó gombák ritkán okoznak alsó légúti fertőzést Steril szövetminták, folyadékok: pl. liquor, vér, peritoneális folyadék Direkt mikroszkópos vizsgálatok eredményét azonnal jelenteni szükséges Szabályosan vett mintában a gomba elemek jelenléte mindenképpen kórjelző AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / V.

28 Mikrobiológiai vizsgálatok Natív készítmény Gram-festés Calcofluor white festés Tusfestés Hisztopathológiai vizsgálatok Giemsa Gömöri methénamin ezüst festés Perjódsav-Schiff reakció Hematoxylin-eosin Mucicarmin AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / VI.

29 1. Candidiasis pseudhyphák és blastoconidiumok 2. Dermatophytosis hífák és arthroconidiumok „ectothrix” M. canis „endothrix” T. tonsurans Haj 3. Coccidioidosis sphaerula endoconidiumokkal KOH kezelés KOH + Calcofluor white kezelés A. Tárgylemez készítmények Natív készítmény / fény-, fáziskontraszt-, fluoreszcens mikroszkóp Minta: bőrkaparék, köröm, hajszál, nyálkahártya, vizelet, légúti minta, … 1.) Vizsgálat: a mintát KOH-dal emésztjük (átlátszóvá válik) a.) a mintát tárgylemezre tesszük + 1 csepp 20% KOH + fedőlemez b.) hőkezelés (30 0 C, 20 perc) / ha keratintartalmú a minta: + 30 perces inkubálás szobahőn, c.) fénymikroszkópban vagy fáziskontraszt mikroszkópban vizsgáljuk 2.) Vizsgálat: a.) a mintát KOH + kalkofluor-fehér (kitinhez kapcsolódik) keverékkel kezeljük b.) fluoreszcens mikroszkópban vizsgáljuk 1. http://en.wikipedia.org/wiki/KOH_test#/media/File:Vaginal_wet_mount_of_candidal_vulvovaginitis.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/KOH_trichogram.jpg 2. http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3199404_ad-23-S11-g002&req=4 3. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Spherule_of_Coccidioides_immitis_with_endospores_PHIL_481_lores.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / VII.

30 B. Tárgylemez készítmények Natív készítmény / fénymikroszkóp Tus-festés: Cryptococcus neoformans fertőzés diagnosztika Minta: liquor, vizelet Vizsgálat: a.) centrifugálás b.) a szedimentum egy cseppjét tussal összekeverjük + fedőlemez c.) fénymikroszkópban vizsgáljuk Pozitív eredmény: sötét háttér / eltérő méretű sarjadzó sejtek szellemképe, a tokjuk nem festődő udvarával Szenzitivitás: alacsony Ritkán végzik – direkt Ag kimutatás érzékenyebb vizsgálat! http://en.wikipedia.org/wiki/Cryptococcus_neoformans#/media/File:Cryptococcus_neoformans_using_a_light_India_ink_staining_preparation_PHIL_3771_lores.jpg AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / VIII.

31 C. Tárgylemez készítmények Fixált készítmény Kalkofluor fehér festés Gram-festés Legtöbb gomba Gram-pozitív festődésű Giemsa Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum (intracelluláris sarjadzó sejtei) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt mikroszkópos vizsgálatok / IX.

32 Cél: invázív aspergillózis diagnózisa (egyéb vizsgálatok mellett) és az antifungális kezelés monitorozása ELISA: Galactomannan (GM) sejtfal antigén kimutatás Minta: szérum, bronchoalveoláris lavage (BAL), (liquor?) Szenzitivitás: magas (97.4%); specificitás: jó (90.5%) Álpozitív eredmények okai: Egyéb gomba és bakteriális fertőzések, Antibiotikum terápia,? Bizonyos ételek elfogyasztása AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt antigén kimutatás / I.

33 Cél: a Cryptococcus neoformans fertőzés diagnózisa Tok antigén (glucuronoxylomannan) kimutatás / latex-agglutináció, ELISA Minta: liquor, szérum Szenzitivitás: magas (100%); specificitás: magas (93-100%) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt antigén kimutatás / II.

34 Cél: invázív candidiasis diagnózisa Latex-agglutináció: Candida Ag kimutatása Minta: szérum Szenzitivitás: alacsony (13-38%); specificitás: jó (82-93%) ) ELISA: Candida mannan Ag (sejtfal) kimutatás Minta: szérum Szenzitivitás: 58%; specificitás: 93% Kombinálhatjuk ellenanyag vagy 1,3-beta-D-glucan (BDG) kimutatással: szenzitivitás:↑ (83%); specificitás: ↓ (86%) A pozitív eredményt napokkal korábban kaphatjuk, minthogy a hemokultúra pozitívvá válna (kb. 6 nappal) és pozitív Rtg változások jelentkeznének (kb. 16 nappal) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt antigén kimutatás / III.

35 Cél: endémiás gombafertőzések diagnózisa Histoplasmosis ELISA: Histoplasma Ag Minta: szérum, vizelet, BAL Immuncompromittált betegek: Szenzitivitás: jó (92-94%) ↔ ellenanyag kimutatás szenzitivitása alacsonyabb (69-84%) Immunkompetens betegek: Szenzitivitás: alacsony (39-80%) ↔ ellenanyag kimutatás szenzitivitása magasabb 86-100%) A fertőzés első 3 hetében (az ellenanyagok megjelenése előtt): érzékenysége megfelelő Coccidioidomycosis ELISA: Coccidioides Ag Minta: vizelet Szenzitivitás: alacsony (71%), specficitás: magas (99%) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Direkt antigén kimutatás / IV.

36 Cél: Invazív aspergillosis, candidiasis diagnózisa ( és Pneumocystis jirovecii fertőzés?) Módosított LAL vizsgálat: 1,3-beta-D-glucan (BDG) („panfungális marker”) kimutatás Nem specifikus: 1,3-beta-D-glucan több gomba faj és növény (pl. búza, rozs, árpa) sejtfalának komponense Kivéve: Mucormycetes, Cryptococcus spp., Blastomyces sarjadzó alakja Minta: szérum, (liquor?) Kimutatás nem ellenanyaggal történik, hanem Limulus Amoebocyta Lizátummal (LAL) LAL + BDG = kromofor keletkezik / detektálás spektrofotometerrel Szenzitivitás: alacsony (83%), specificitás: jó (93%) Interpretálás: álpozitív eredmények / pl. hemodialízis, immunglobulin készítmények AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sejtfal komponens direkt kimutatása

37 Tenyésztés AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

38 A gombák a baktériumok tenyésztésére szolgáló táptalajokon is nőnek A növekedés azonban lassabb Az identifikáláshoz szükséges struktúrák, spórák nem, vagy lassan fejlődnek ki Tenyésztéshez kétféle gomba táptalajt használhatunk: nem-szelektív és szelektív táptalajokat (ha egyéb mikroorganizmus is jelen lehet) Nem-szelektív táptalaj: gyors és lassú növekedésű gomba is képes nőni rajta Cikloheximid tartalmú szelektív táptalaj: csak a lassú növekedésűek nőnek rajta AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / I.

39 A táptalaj választás függ: az infekciótól a várható kórokozótól az anatómiai helytől, ahonnan a minta származik (steril, nem-steril) 1. Nem-szelektív, primer gombatáptalajok Brain Heart Infusion Agar (BHI) Borjú agy és marhaszív infuzátum, 5-10% birkavér Sabouraud Dextróz Agar (SDA) Pepton, dextróz, pH 5.5 Elsősorban a dermatophytonok és a sarjadzó gombák tenyésztésére szolgál Tápanyagban gazdagabb táptalajról átoltva jellemző telepmorfológiát kapunk Sabouraud Brain Heart Infusion Agar (SABHI) Összes klinikai szempontból fontos gomba képes nőni rajta Egyes gombák növekedési faktorokat igényelnek: pl. oliva olaj / Malassesia furfur AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / II.

40 1. Szelektív táptalajok A primer gomba táptalajok + antibiotikumok +/- cikloheximid Antibiotikumok Penicillin, streptomycin, gentamicin, chloramphenicol, … Gátolják a kísérő vagy kontamináló bakteriális flóra növekedését Cikloheximid (eukaryota sejtek fehérjeszintézisét gátolja) A gyorsan szaporodó, kontamináló, környezeti gombákat gátolja Egyes opportunista kórokozó gombák (pl. Aspergillus spp., Candida spp, Cryptococcus neoformans) érzékenyek cikloheximidre Tenyésztésükhöz cikloheximidet nem tartalmazó táptalajt kell használni Ha cikloheximides táptalajt használunk, akkor párhuzamosan egy cikloheximidet nem tartalmazót is be kell állítani AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / III.

41 Chrom-agar Differenciáló táptalaj Differenciáló, kromogén szubsztrátot tartalmazó szelektív agar A négy legfontosabb Candida species telepeinek színe eltérő: C. albicans C. krusei C. tropicalis C. glabrata Használatának előnye: Direkt izolálás + prezumptív identifikálás párhuzamosan Egy nappal csökkenhet a vizsgálat ideje AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / IV.

42 Hemokultúra palackok táptalajai Fungémia detektálása folyékony táptalajban vagy szilárd táptalajon lysis-centrifugálást követően Folyékony táptalajt használó automata rendszerek Gombák növekedését támogató palackok használata lerövidíti a vizsgálatok idejét Candidák jól nőnek a bakteriális, aerob palackokban is A tenyésztés eredményét körültekintően kell értelmezni: Álpozitív eredmény: gombák kontaminálhatják a palackokat! Álnegatív eredmény: invázív fonalas gomba fertőzés esetében előfordulhat! Lízis-centrifugálás Intracelluláris dimorf gombák Sarjadzó gombák, fonalas gombák AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / V.

43 Edényzet: Petri csésze: Előny: nagy felszín, könnyebb kezelhetőség Hátrány: könnyen kiszárad, kevésbé biztonságos érdemes vastagabbra önteni és légáteresztő ragasztószalaggal zárni Kémcső (csavaros kupakos) Előny: biztonságosabb, lassabban szárad ki Hátrány: kis felszín, nehezebb átoltás és mintavétel? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / VI.

44 Tenyésztési hőmérséklet Legtöbb gomba 25 – 30 0 C Candidák 35-37 0 C-on is növekednek Dimorf gombák - tenyésztés kétféle hőmérsékleten: 25 0 C (SDA) – fonalas forma 37 0 C (BHI) – sarjadzó forma Inkubációs idő 5 nap - 8 hét Felületes nyálkahártya fertőzés (candidiasis?): 5 -7 nap Histoplasma capsulatum 6 – 8 hét AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Tenyésztés / VII.

45 Identifikálás AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

46 Az identifikálás céljai: Diagnosztikus Epidemiológiai Terápiás Az identifikálás szintjei: Prezumptív Definitív AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Identifikálás (ID) Az identifikálást segítő vizsgálatok: Sarjadzó gombák Makro- és mikromorfológia Biokémia (asszimiláció, fermentáció) Antigén kimutatás Molekuláris vizsgálatok: hibridizáció, amplifikáció, MALDI-TOF Fonalas gombák Makro- és mikromorfológia Molekuláris vizsgálatok: hibridizáció, amplifikáció, MALDI-TOF

47 Primer tenyészetek megtekintése Szilárd táptalajokon / pozitív hemokultúra palackokban (egyéb folyékony táptalajban) Kérdés: sarjadzó, fonalas, vagy dimorf gomba növekedett-e? A prezumptív identifikálás a tenyészet makro- és a mikromorfológiája alapján történik 1. Makromorfológia vizsgálata szilárd táptalaj telepein? Telepek konzisztenciája, textúrája, nagysága, színe, alakja, Telepeket alulról és felülről is kell vizsgálni Szaporodás, növekedés gyorsasága Sarjadzó gombák: krémes konzisztenciájú, baktériumokéhoz hasonlatos telepek Fehér, krémszín: Candida sp? Piros: Rhodotorula sp.? Fonalas gombák: levegős, gyapjas textúrájú telepek Narancssárga: Microsporum sp.? Szürke, fekete: : Aspergillus sp.? Dimorf gombák: 25 0 C / sarjadzó gomba; 37 0 C / fonalas gomba AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Prezumptív ID / I.

48 Sarjadzó gombák Méretük? Alakjuk? Elrendeződésük? Pszeudohífa? Tok (tusfestéssel)? Sporuláció fajtája? Fonalas gombák Hyphák Szeptáltak? Nem-szeptáltak? Elágazódóak? Elágazódásuk szöge? Pigmentáltak? Átmérőjük? Arthroconidiumok ? Spóratartó képletek strukturája Conidiumok Exo- vagy endoconidiumok? Méretük? Színük? Elrendeződésük? 2.a. Mikromorfológia (mikroszkópos) vizsgálata szilárd táptalaj telepein? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Prezumptív ID / II.

49 Sarjadzó gombák Méretük? Alakjuk? Elrendeződésük? Pszeudohyphák? Tok (tusfestéssel)? Sporuláció fajtája? Fonalas gombák Hyphák Szeptáltak? Nem-szeptáltak ? Elágazódóak? Elágazódásuk szöge? Pigmentáltak? Átmérőjük? Arthroconidiumok ? 2.b. Mikromorfológia (mikroszkópos) vizsgálata folyékony tenyészetből pl. pozitív hemokultúra Gram-szerint festett kenetének vizsgálata Kérdés: sarjadzó, fonalas, vagy dimorf gomba növekedett-e? Majd kioltás megfelelő szilárd táptalajra AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Prezumptív ID / III.

50 Tok nélküli izolátum Átoltás Chrom-agar: pl. C. albicans telepek zöld színűek Kukorica agar: a C. albicans chlamydoconidium képzésének igazolására Csíratömlő képzés vizsgálata Biokémiai gyors próbák: pl. ureáz, trehalóz Tokkal rendelkező izolátum Átoltás Birdseed agar: pl. Cryptococcus neoformans = barna telepek Biokémiai gyors próbák: pl. kávésav-korong, ureáz, nitrát AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gomba prezumptív ID / I.

51 Csíratömlő (germinális tubulus) képzés Csíratömlő: sarjadzó sejtből laterálisan kinyúló „cső” Egy meghatározott formája csak a C. albicans (és C. dubliniensis) izolátumokra jellemző Kivitelezés: Kis mennyiségű gombatenyészetet borjú szérumban szuszpendálunk Inkubálás: 37 0 C, 1-2 óra Majd a tárgylemezre kitett és fedőlemezzel takart szuszpenziót mikroszkópban vizsgáljuk AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gomba prezumptív ID / III. http://en.wikipedia.org/wiki/Germ_tube

52 Tenyésztés fedőlemez alatt Chrom-agar Cornmeal agarBird seed agar 3-4 legfontosabb Candida species a telepek színe alapján elkülöníthető C. albicans, C.krusei, C. tropicalis (C. glabrata) Candida albicans-ra jellemző chlamydoconidium képződés Barna telepek: Cryptococcus neoformans AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gomba prezumptív ID / IV. http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail_10652_14827738__-1_0 http://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/File:Candida_albicans_2.jpg http://www.ijdr.in/viewimage.asp?img=IndianJDentRes_2012_23_4_490_104956_f12.jpg https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/211132.pdf

53 Példák Candida albicans: Mikroszkóp: blastoconidium +, pszeudohypha + Csíratömlő + Chrom-agar: zöld telepek Cornmeal agar: chlamydoconidium + Candida glabrata: Mikroszkóp: blastoconidium (kisméretű) +, pszeudohypha - Csíratömlő - Chrom-agar: halvány lila Cornmeal agar: chlamydoconidium - Biokémia: trehalóz + Cryptococcus neoformans Tusfestés: tok + Bird seed agar: barna telepek Biokémia: kávésav-korong teszt + AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gomba prezumptív ID / V.

54 Kereskedelmi forgalomban kapható biokémiai kitek Asszimilációs +/- fermentációs vizsgálatok Manuális Automata Antigén kimutatási vizsgálatok Nukleinsav alapú molekuláris vizsgálatok Hybridizáció (PNA-FISH) Amplifikáció Protein alapú molekuláris vizsgálatok MALDI-TOF AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Sarjadzó gomba definitív ID

55 Mikroszkópos vizsgálattal történik Megfigyelhető morfológiai tulajdonságok: Hífák Szeptáltak? Nem-szeptáltak? Elágazódóak? Elágazódásuk szöge? Pigmentáltak? Átmérőjük? Arthroconidiumok? Üreges szerv metszetében, a fentieken kívül: Spóratartó képletek struktúrája? Conidiumok? Megfigyelhető morfológiai tulajdonságok: Hífák Szeptáltak? Nem-szeptáltak? Elágazódóak? Elágazódásuk szöge? Pigmentáltak? Átmérőjük? Arthroconidiumok? Spóratartó képletek struktúrája Conidiumok Exo vagy endoconidiumok? Méretük, színük, elrendeződésük? AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fonalas gomba prezumtív ID Kérdés: Aspergillus? Mucor? dermatophyton? dimorf gomba? …… B. Primer tenyészetrőlA. Mintából közvetlenül

56 Mikroszkópos vizsgálattal történik! A tenyésztés primer táptalajai nem alkalmasak definitív identifikálásra! Tápanyagokban gazdagok, így a hífák növekedése jó, de a sporuláció gyenge és a gombák gyakran nem színtenyészetben növekednek A definitív identifikálás alapjai: Színtenyészet és megfelelő sporuláció szükséges A primer tenyészeteket át kell oltani tápanyagokban kevésbé gazdag táptalajokra pl. Burgonya Dextróz Agar, Czapek-Dox agar A mikroszkópos vizsgálatokat az arra alkalmas, új szubkultúrákból kell megismételni! AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fonalas gombák definitív identifikálása

57 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁTKORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Az identifikálás (prezumtív és definitív) mikroszkópos vizsgálati módszerei Tárgylemez „mikrokultúra”: Petri csészében üvegbotokra tárgylemezt helyezünk Tárgylemez közepére kis darab agar táptalajt teszünk Széleit beoltjuk a gombával Fedőlemezt teszünk rá és inkubáljuk Tárgylemez preparálás: A tenyészetről tű segítségével veszünk mintát, tárgylemezre helyezzük egy csepp festékben, olyan módon, hogy a gomba struktúrái érintetlenek maradjanak, majd fedőlemezt teszünk rá Lenyomati készítmény: A tenyészetről Cellux-al veszünk mintát, amit tárgylemezre ragasztunk Készítmények festése: Laktofenol-gyapotkék AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fonalas gomba ID módszerek

58 Szerológia AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

59 I. Opportunista kórokozók invazív fertőzéseinek diagnosztikája Immunszupresszált állapot: invazív gombafertőzés kockázata ↑ Aspergillosis, candidiasis, Cryptococcus neoformans fertőzés, …. Szerológiai diagnózis ELISA Eredmények interpretálása Pozitív eredmény: Nehéz értelmezni Valós eredmény? Korábbi expozíció? Szignifikáns eredmény: ≥ 4x titeremelkedés Negatív eredmény: Immunszupresszált állapotokban álnegatív eredmény előfordulhat AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Szerológia / ellenanyag kimutatás

60 II. Endémiás, dimorf gomba fertőzések diagnosztikája Histoplasmosis, coccidioidomycosis, …. Kialakulhatnak akár egészséges, immunkompetens emberekben Szerológiai diagnosztika Komplement-kötési reakció(KKR), Immundiffúzió (ID) Eredmények interpretálása: keresztreakciók gyakoriak az egyes kórokozók antigén preparátumai között AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Szerológia / ellenanyag kimutatás

61 Antimikotikum érzékenységi vizsgálatok AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

62 I. Szisztémásan alkalmazható szerek Polyenek (ergoszterolhoz kötődnek) pl. amphotericin B Azolok - ergoszterol szintézist (lanoszterol-14-alfa-demetilázt) gátolják triazolok: pl. flukonazol, voriconazol, posaconazol Echinocandinok - glukán szintézist gátolják Pl. caspofungin, micafungin, anidulafungin 5-fluorocytosin - antimetabolit: RNS, DNS, fehérje szintézist gátolja Flucytosin II. Lokálisan használható szerek Azolok imidazolok: pl. miconazol Allylaminok - ergoszterol szintézist (lanoszterol-demetilázt) gátolják pl. terbinafin, naftifin AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Legfontosab antifungális szerek

63 I. Identifikálás: az empírikus terápia tervezésének fontos vizsgálata Az antimikotikum érzékenységi vizsgálat első fontos lépése az izolált törzs identifikálása Az identifikálás eredménye alapján meghatározható az izolátum természetes rezisztenciája és érzékenysége, valamint megbecsülhető szerzett rezisztenciája is Ez alapján megtervezhető az empírikus kezelés figyelembe véve a terápiára vonatkozó ajánlásokat II. A célzott terápia tervezéséhez szükséges egyéb laboratóriumi vizsgálatok A gombák antimikotikum érzékenységének meghatározásához a baktériumok antibiotikum érzékenységi vizsgálataihoz hasonló módszereket alkalmaznak AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Antimikotikum érzékenységi vizsgálatok