Elektromágneses spektrum. Tartalom I.Kvantumfizika - alapjelenségek 1.Fekete test hőmérsékleti sugárzása 2.Foton hipotézis II.Atomspektrumok, molekulaspektrumok.

Az előadások a következő témára: "Elektromágneses spektrum. Tartalom I.Kvantumfizika - alapjelenségek 1.Fekete test hőmérsékleti sugárzása 2.Foton hipotézis II.Atomspektrumok, molekulaspektrumok."— Előadás másolata:

1 Elektromágneses spektrum

2 Tartalom I.Kvantumfizika - alapjelenségek 1.Fekete test hőmérsékleti sugárzása 2.Foton hipotézis II.Atomspektrumok, molekulaspektrumok 1.A hidrogén atom színképe 2.Atomspektrumok 3.Molekulaspektrumok 4.Elektronállapotok közötti átmenetek III. Elektromágneses spektrum 1.Az elektromágneses spektrum tartományai 2.Emissziós, abszorpciós spektrum 3.Spektrométerek

3 Tartalom IV.Abszorpciós fotometria 1.Atomabszorpciós spektrofotometria 2.Abszorpciós molekula spektroszkópia 3.Fotodinamikus hatás V. Lumineszcencia 1.Fluorimetria 2.Fluoreszcenciás mérési módszerek

4 I/1. A fekete test hőmérsékleti sugárzásának értelmezése Kirchoff-törvénye: Egy test e emisszóképességének és a abszorpcióképességének hányadosa állandó:e(,T)/a(,T) = E(,T) Stefan-Boltzmann törvény Wien-féle eltolódási törvény Planck-féle sugárzási törvény: A fekete test sugárzást elemi (atomi) oszcillátorok adják. Ezek az oszcillátorok azonban nem vehetnek fel tetszőleges energiát, csak meghatározott diszkrét energiával rendelkezhetnek. A Planck-féle sugárzási formula: l : hullámhossz c 1, c 2 : állandók T : hőmérséklet

5 I/2. További kvantumos jelenségek Fényelektromos hatás (kísérleti eredmények): Fény hatására elektronok léphetnek ki egyes fémek felületéről. A kilépő elektronok sebessége csak a fény hullámhosszától függ, a fényintenzitásától nem. A fény intenzitásának növelésével nő a kilépő elektronok száma. Magyarázat (Einstein): A fény kvantumos természetű, fotonhipotézis. Franck-Hertz kísérlet: Az atomok csak jól meghatározott méretű energia adagokat vesznek fel az elektronokkal való ütközés során (gerjesztés).

6 II/1. A hidrogén atom színképe A hidrogén színképe jól elkülönülő vonal sorozatokból áll. Modell: elektron hiperbolikus potenciálvölgyben. A modell jól visszaadja a már korábban kísérletezéssel megtalált formulát a hidrogén színképében lévő vonalakra. Csak meghatározott energiájú fotonokat abszorbál. R H = 3,3*10 15 s -1 : a H atom Rydberg-állandója n = 1, 2, 3, … ; k = 2, 3, … : természetes számok

7 II/2. Atomspektrumok Vegyértékelektron-modell: A hidrogénszerű ionok (He +, Li ++, Be +++,stb.), és alkálifémek (Li, Na, K, stb.) spektruma, a „világító elektron”-modell. Többelektronos atomok: A spektrumot a Schrödinger-egyenlet megoldásával kaphatnánk. Ez azonban csak közelítő modellek alapján lehetséges. Finomszerkezet: A spektrumban finomszerkezet figyelhető meg, a Bohr- Sommerfeld atommodell magyarázza (mellékkvantumszám bevezetése). Hiperfinom szerkezet: elektron-mag csatolás, (esetleg izotópok miatt)

8 II/3. Molekulaspektrumok Komplex molekulaszerkezet – komplex spektrum. A molekula energiaszintjei három különböző energiatartományba eső tag összegétől függenek (Born-Oppenheimer közelítés): Elektronkonfiguráció – közeli infravörös, látható, ultraibolya Magok rezgése egyensúlyi helyzetük körül – infravörös modell : parabolikus potenciálvölgy Molekula forgása – távoli infravörös, mikrohullám

9 II/4. Elektronállapotok közötti átmenetek Energia átmenetek: abszorpció termikus relaxáció fluoreszcencia sugárzás nélküli (rendszerek közötti) átmenet foszforeszencia S 0 : alapállapot S 1 -S 2 : gerjesztett (szigulett) állapotok T 1 : első triplett állapot Jablonski-diagram: molekula energiaszint rendszere – elektron gerjesztési energiaszintjei a molekula vibrációs szintjeivel

10 II/4. Elektronállapotok közötti átmenetek Abszorpció: legalsó vibrációs szintről Fluoreszcencia: első gerjesztett szingulett állapot (Kasha- szabály) legalsó vibrációs szintjéről  Eltolódás figyelhető meg az emisszió és abszorpció energia- szintjei között (Stokes-féle eltolódás). Tükörkép szabály: abszorpció és emisszió spektruma általában tükörszimmetrikus

11 Összegzés Ha egy anyag bizonyos hullámhosszú fotont bocsát ki, akkor ugyanazt el is tudja nyelni. => Egy adott anyagra jellemző a színképe. A fény kvantumos természete, foton. Az atomokban, molekulákban lévő elektronok energiaszintjei diszkrétek. Az energiaszintek között átmenetek lehetségesek – pl. megfelelő energiájú foton elnyelésével vagy kibocsátásával. Molekulák energiaszintjei függenek a vibrációs és rotációs energiától is.

12 III. Elektromágneses spektrum A fényintenzitás, vagy azzal arányos, analóg mennyiség a frekvencia, hullámhossz, vagy energia függvényében.

13 III/1. Az elektromágneses spektrum tartományai HullámhosszMegnevezésEredet/Hatás <0,1 nm  -sugárzás Magenergia átmenetek 0,1-1 nmkemény röntgenBelső elektronhéjak 1-10 nmlágy röntgenKülső elektronhéjak 10-400 nmultraibolyaElektronátmenetek külső pályákon 400-700 nmlátható fény 0,7-400  m infravörösForgási, rezgési átmenetek 0,4-250 mmmikrohullámokElektronspin orientáció >250 mmrádióhullámokMag mágneses momentum

14 III/2. Emissziós, abszorpciós spektrum Emissziós spektrum: Gerjesztett atomok által kibocsátott spektrum. Maga a minta a fényforrás. Abszorpciós spektrum: Fényelnyelődés a mintában. Vonalas spektrum keletkezése: Emisszió esetében a kibocsátott, abszorpció esetében az elnyelt foton energiája megegyezik az adott elem vagy molekula két energiaszintjének különbségével:

15 III/3. Spektrométerek Cél: a minta által adott hullámhosszúságon elnyelt, kibocsátott fény intenzitásának mérése. Emissziós üzemű spektrométer: Abszorpciós üzemű spektrométer:

16 IV. Abszorpciós fotometria Fény-anyag kölcsönhatás I 0 : beeső fény intenzitása I T : transzmittált (áteresztett) fény intenzitása I A : abszorbeált (elnyelt) fény intenzitása I R : reflektált (visszavert) fény intenzitása Transzmisszió: Optikai denzitás:

17 IV. Abszorpciós fotometria Fényelnyelés anyagban Lambert-törvénye: A fény az anyagon való áthaladás közben veszít intenzitásából. Az intenzitás csökkenés (  I) arányos az intenzitással(I) és az anyagban megtett út hosszával (  x). k( ) : abszorpciós együttható, anyagi minőségtől és a fény hullámhosszától függ I 0 : beeső fény kezdeti intenzitása

18 IV. Abszorpciós fotometria Beer-Lambert-törvény: Az abszorpciós együttható arányos a mintában lévő abszorbeáló anyag koncentrációjával. k( ) –ból meghatározható az elnyelő anyag koncentrációja. Oldatok összetételének mérésére a Lambert-törvény alakja:  ( ) : moláris extinkciós koefficiens, függ a hullámhossztól, hőmérséklettől, nyomástól, anyagi minőségtől c : koncentráció l : rétegvastagság

19 IV. Abszorpciós fotometria Beer-Lambert-törvény érvényességének feltételei monokromatikus mérőfény kémiailag egynemű oldat oldószer nem módosítja a minta abszorpcióját a minta nem szórja a mérőfényt és nem fluoreszkál Gyakorlati problémák kifehéredés: indukált emisszió – gerjesztett molekula ütközés során gerjesztési energiáját elveszíti, újabb foton keletkezik (nagy intenzitású fényforrás esetén jelentős) „stray light effect”: abszorbancia és koncentráció nem egyenesen arányos – a monokromátorból felharmónikusok is távoznak

20 IV. Abszorpciós fotometria Fény behatolási mélysége a bőrbe erősen hullámhosszfüggő, legnagyobb az infravörös tartományban.

21 IV/1. Atomabszorpciós spektrofotometria Alapelvek A mintát előzetesen atomizálni kell. (pl. láng) A keresett atomra jellemző hullámhosszúságú fénnyel gerjesztjük a mintát – rezonancia módszer. (hullámhossz kiválasztása pl. monokromátorral) Az elnyelt fény intenzitása arányos az abszorpcióra képes atomok számával => koncentráció számítható. Felhasználás: Alkotó elemek kimutatása. Alkotó elemek mennyiségi meghatározása.

22 IV/1. Atomabszorpciós spektrofotometria Eredmények: A módszerrel nagyon sok elem vizsgálható. Nem határozhatók meg azok az elemek, amelyek rezonancia vonalai a levegőben is megtalálhatók (pl.: C, halogének, S). ppm, ppb teljesítmény Alkalmazás: Környezetvédelem, élelmiszeripar, egészségügy. (pl. toxikus elemek (ólom,higany) kimutatása) Vérben lévő elemek koncentrációjának meghatározása jelentős diagnosztikai eszköz. (pl.: Na, K – elektrolitháztartás; Li, Cu, Al )

23 IV/2. Abszorpciós molekula spektroszkópia Alkalmazás Oldatok koncentrációjának mérése. Pl. fehérjeoldatok Időbeli változások detektálása. Elektroforézis nyomon követése. Leggyakrabban UV és a látható tartományban alkalmazzák. Kromofór (fényt elnyelő) molekulák az emberi szervezetben Endogén kromofórok pl. nukleinsavak, fehérjék Exogén kromofórok pl. ételfestékek, gyógyszerek

24 IV/2. Abszorpciós molekula spektroszkópia Fehérjék abszorpciója Fehérjeépítő aminosavak - fenilalanin, triptofán, tirozin - abszorpciós spektruma vizes oldatban

25 IV/3. Fotodinamikus hatás Fotodinamikus terápia (PDT), fotodinamikus diagnosztika (PDD) onkológia ígéretes ágazata alapja: a fotoszenzibilátor anyagok a tumorban nagyobb mennyiségben halmozódik fel, mint a normál szövetben megfelelő hullámhosszú fénnyel gerjesztik a festékanyagot (látható vörös tartományban, mivel itt nagy a szervezet fényáteresztő képessége) a gerjesztett festék energiája felhasználásával szingulett állapotú oxigént állít elő (nagyon aktív) oxidáció következményeként roncsolódik a sejt PDD: gerjesztés után fluoreszkál a festék, „láthatóvá” teszi a tumorszövetet

26 V. Lumineszcencia Def.: Egyes anyagok spontán fénykibocsátása elektrongerjesztést követően. Fajtái: (elektrongerjesztés módja) Fotolumineszcencia (foton elnyelése) Kemo-,biolumineszcencia (kémiai reakció) Elektrolumineszcencia (elektromos tér) Termolumineszcencia (hőközlés) Tribolumineszcencia (mechanikai energia, pl. deformáció)

27 V. Lumineszcencia Jellemző tulajdonságok Abszorpciós spektrum Emissziós spektrum Emisszió kvantumhatásfoka Gerjesztett állapot élettartama N: gerjesztett molekulák száma  : gerjesztett állapot élettartama Az emisszió polarizáció foka I V : vertikális polarizáció I H : horizontális polarizáció

28 V/1. Fluorimetria Fluoreszcencia jelenségén alapuló spektroszkópiai módszer. Atomok, molekulák egy része gerjesztés hatására fluoreszkál, vagy más módszerek segítségével (pl. kémiai reakció) fluoreszcenciára vehető. A kibocsátott fény hullámhossza eltér a gerjesztő fénytől, ami pontos mérést tesz lehetővé. Fluoriméter felépítése: - fényforrás: gerjeszti a fluoreszkáló mintát – ívlámpa, gázkisülési cső, lézer - a minta által emittált fény felbontását végző monokromátor - detektor

29 V/1. Fluorimetria Eljárás: a mérendő vegyületet extrahálni kell a vizsgált anyagból alkalmas oldószerrel kell feloldani (az oldószer ne legyen érzékeny a mérésben használt hullámhosszakra) kalibrációs görbe előzetes felvétele csak híg oldatok esetén van egyenes arányosság a fluoreszcencia intenzitása és a fluoreszkáló anyag koncentrációja között

30 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Atomfluoreszcencia: Kis mennyiségek esetén pontosabb lehet, mint az atomabszorpciós fotometriai módszer. Molekulák, vegyületek meghatározása: Orvosi, diagnosztikai felhasználás: Porfirinek - vérből, vizeletből székletből Katekolaminok – vizeletből Kortizol – vérből Ösztrogén hormonok - vizeletből

31 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Immunofluoreszcencia Szervezetbe kerülő testidegen anyagok immunreakciót váltanak ki, a szervezet antitesteket termel. Ismeretlen mennyiségű antigént tartalmazó mintához ismert mennyiségű fluoreszcens antigént tartalmazót kevernek. A jelölt, jelöletlen antigének kötődnek az antitestekhez. A fluoreszcencia mértékéből lehet számítani a nem jelölt antigének arányát. A fehérjék jelzése pl. fluoreszcin-izotiocianáttal (FITC) történik. Gyors, nagy érzékenységű módszer. A módszer nem tökéletesen specifikus egy adott antigénre.

32 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Véredények vizsgálata fluoreszcencia segítségével Maga a vér és a véredények nem fluoreszkának. Savas fluoreszcenciás festéket juttatnak a véráramba. A festék a véredényekben szétterjedve láthatóvá teszi azokat. pl. - angiográfiában alkalmazzák koszorúerek vizsgálatára - onkológiában tumorok felismerésére, méretének becslésére

33 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fluoreszcencia aktivált sejtanalízis és sejtszeparálás Heterogén sejtpopulációk sejtenkénti analízise. A különböző sejteket tartalmazó szuszpenziót olyan kicsi cseppekre porlasztják, amik maximum egy sejtet tartalmaznak. A cseppek a szétbontás közben elektromos töltést is kapnak. A cseppeket egyesével gerjesztik (lézerrel). A sejteket tartalmazó cseppeket osztályozni lehet a sejt fluoreszcenciájának detektálásával. Végül elektromos térben minden cseppet a neki megfelelő edény irányába térítenek el.

34 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fluoreszcencia aktivált sejtanalízis és sejtszeparálás (folyt.) Eredmények, alkalmazás: Nagyon gyors módszer (10e sejt/sec) Rákos sejtek analízise, szétválasztása Gyógyszerek hatásának vizsgálata Kromoszóma vizsgálat Sejten belüli enzim aktivitás Lektinkötőképesség DNS-RNS tartalom mérése

35 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek Fehérjék, aminosavak vizsgálata A fenilalanin, tirozin, triptofán UV hatására fluoreszkál. A fluoreszcencia jellemzőit az aminosavak környezete befolyásolja. => Fehérjedinamikára, a fluoreszkáló aminosav térbeli hozzáférhetőségére lehet következtetni. Nukleinsavak vizsgálata Nem, vagy gyengén fluoreszkál. Festék hozzáadása szükséges.

36 V/2. Fluoreszcenciás mérési módszerek FRAP (fluorescent recovery after photobleaching) A sejt membránján mozgó (a membrán síkján) molekulák nyomon követése. A vizsgálni kívánt membránkomponenseket megjelölik fluoreszkáló festékkel, megzavarják egyenletes eloszlásukat. Kis területen lézerrel megvilágítva elroncsolják a felületen lévő festékmolekulákat. A többi festett molekula diffúzióját a fakított területen meg tudják figyelni fluoreszcencia intenzitásának időbeli változásából. pl. fehérjék diffúziójának mérése