Immunoprecipitation Gyakorlati munka I. rész. Kísérleti protokoll Protokoll.

Az előadások a következő témára: "Immunoprecipitation Gyakorlati munka I. rész. Kísérleti protokoll Protokoll."— Előadás másolata:

1 Immunoprecipitation Gyakorlati munka I. rész

2 Kísérleti protokoll Protokoll

3 1.1 Az antitest-oldat előállítása Az AB törzs oldat 7,5 mg IgG/mL-t tartalmaz (Teljes térfogat: 1mL) Pipettázz 100 µL Antitest törzs-oldatot a sárga csőből (AK) a pirosba (AK). Most pipettázz 900 µL NaCl oldatot a piros csőbe (AB) Keverd össze az AB-oldatot úgy, hogy többször fel-le pipettázod az oldatot. Figyelj oda, hogy amikor kevered, csak az első megállásig pipettázz, különben levegőbuborékok keletkezhetnek! 1. A kísérlet előkészítése

4 1.2 Az antigén-oldat hígítása Pipettázz 40 µl-t a lila csőből (AG) a kék csőbe (AG) Most pipettázz 960 µL NaCl oldatot a kék csőbe (AG) Keverd össze az AG-oldatot úgy, hogy többször fel-le pipettázod. 1. A kísérlet előkészítése

5 2.1 Pipettázz minden üregbe (1 – 7) 100 µl NaCl-oldatot. 2.2 Pipettázz 200 µL AG-oldatot a kék csőből a 8-as üregbe 87654321 200 µL AG 2. A hígítási sorozat előkészítése

6 2.3 Pipettázz100 µL AG-t a 8-as üregből a 7-esbe. 2.4 Keverd össze a 7-es üreg tartalmát úgy, hogy többször fel-le pipettázod. Figyelj oda, hogy amikor kevered, csak az első megállásig pipettázz, különben levegőbuborékok keletkezhetnek! 876 5 4321 200 µL AG 2. A hígítási sorozat előkészítése

7 2.5 A 7-es üregből pipettázz 100 µL-t a 6-os üregbe. 2.6 A kút tartalmát keverd össze úgy, hogy többször fel- le pipettázod. Vidd véghez úgyan úgy -mint korábban– az 1-es üregig 2.7 Most mérj ki100 µL-t az 1-es üregből. 100 µL 876 5 43 21 100 µL kimérése 2. A hígítási sorozat előkészítése

8 2.8 Pipettázz minden üregbe 100 µL AB-t a piros csőből. 2.9Tartsd a tartalmát 5 percig szobahőmérsékleten. 2. A higítási sorozat előkészítése Melyik AG koncentráció jelenik most meg a különböző üregekben?

9 Antitest analitika Gyarkotlati munka II. rész

10 Készítsd elő a csöveket az alábbi pipettázási táblázat alapján. 1. A csövek előkészítése a PAGE-hez

11 1.1 Pipettázz a zöld csőből (LÄ) 25 µL Lämmli-puffert minden üregbe (1-9). 1.2 Pipettázz 15 µL H 2 O-t az 1, 2, 4, 5, 7 and 8-as csőbe, and 5 µL H 2 O-t a 3, 6 és 9-es csőbe. 1.3 Keverd össze a 4-es üreg tartalmát úgy, hogy többször fel-le pipettázod. Pipettázz a 4-es üregből 10 µL csapadékot az 1, 2 és 3-as csövekbe. 1.4 Pipettázz a piros csőből (AB) 10 µL antitestet a 4, 5 és 6-os csőbe. 1. A vizsgálatok előkészítése a PAGE-hez

12 1.4Pipettázz a kék csőből (AG) 10 µL antigént a 7, 8 és 9-es csövekbe. 1.5Pipettázz a sárga csőből (DTT) 10 µL Dithiotreitol-t a 3, 6 és 9-es csövekbe. 1. A csövek előkészítése a PAGE-hez

13 1.6 Tedd a 2, 3, 5, 6, 8 és 9-es csöveket 5 percre 95° C termosztátba. CsőHőDTT AB/AG1-- 2+- 3++ AB4-- 5+- 6++ AG7-- 8+- 9++ 1. A csövek előkészítése a PAGE-hez

14 2. A gél kazetták előkészítése 2.1Nyisd ki a PAGE gél csomagot úgy, hogy elvágod a fekete vonal mentén, és vedd ki a gél kazettát.

15 2.2 Vágd el egy szikével a gél kazetta szalagját a megjelölt vonal mentén, és húzd ki az alsó csíkot. 2. A kísérlet előkészítése

16 3.1 Tedd a gél kazettákat a rövidebb kábellel összekötött tányérral az elektróda állásba. A másik oldalhoz adj egy másik gélt vagy vak kazettát. 3.2 Helyezd az elektróda állást a szorítókeretbe és rögzítsd a szorítókat. 3.3Tedd a szorítókeretet az elektróda állással a puffer tartályba. 3. Az elektroforézis kamra előkészítése

17 4.1 Töltsd meg az elektróda állást TGS-puffer-rel a határig 4.2 Töltsd meg a puffer tartályt 800 ml TGS-puffer-rel. 4.3 Húzd ki a fésűt. 4. A kamra puffer-ral való feltöltése

18 Töltsd meg a gél slot-ot az alábbiakkal: - 20 µL az 1-es csőből - 20 µL a 2-es csőből - 20 µL a 3-as csőből - 5 µL Kaleidoscope protein standard (KS) - 20 µL a 4-es csőből - 20 µL from the tube (5) - 20 µL from the tube (6) - 20 µL from the tube (7) - 20 µL from the tube (8) - 20 µL from the tube (9) ABAGAB/AGKS 5. A gél „slot”-ok megtöltése

19 6.1 Zárd be a gél kamrát és indítsd el az elektroforézist 150V-on. 6.2 Hagyd abba az elektroforézist, amikor a festék eléri a gél alsó végét. 6. Az elektroforézis vizsgálata

20 7.1 Távolítsd el a szorítókeretet és öntsd a puffer-t a puffer tartályba. (A puffer újra használható!) 7.2 Távolítsd el a gél kazettákat. 7. A gél eltávolítása

21 8.1 Nyisd ki az üveg gél tányérokat és tedd a gélt egy festékes edénybe. 8.2 Mielőtt megfested a gélt, vizezd be két percre, majd távolítsd el a vizet. 8.3 Színezd be a gélt úgy, hogy hozzáadsz 100 ml Coomassie-oldatot maximum 30 percre. 8.4 Öntsd a Coomassie-oldatot a tároló üvegbe és adj hozzá 100 ml langyos vizet. 8.5 Tedd a gélt a centrifugába. 8. Fehérje festés

22 Táblázat: Fehérjék moláris tömege a standard Kaleidoszkóp- ban 9.1 Csinálj egy bemért vonalat a standard Kaleidoszkóp segítségével. ProteinColorM MyosinKék201090 Da ß-galactosidaseBíbor133730 Da Bovine albumin Zöld 83559 Da Carbon anhydraseLila 39559 Da Soybeans trypsin inhibitorNarancs 31405 Da LysozymePiros 17408 Da AprotininKék 7081 Da 9. Analízis

23 9.2 Határozd meg minden vonal csoportjának molekuláris tömegét. Melyik csoport melyik fehérjéhez tartozik? 9. Analízis