Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) a diasorhoz.

Az előadások a következő témára: "Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) a diasorhoz."— Előadás másolata:

1 Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) a diasorhoz tartozik a FIG4(T-APC).MPG (998KB)

2 Az immunoesszék érzékenysége

3 A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése 1.A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek által indukált aktiváció α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3 H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika Témák:

4 A humorális immunválasz szakaszai antigén felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció Nyugvó IgM +, IgD + érett B-sejt Antigén Aktivált B-sejt Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió B-sejt Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Nagy affinitású IgG Memória B-sejt Affinitás érés Izotípus váltás Antitest termelés IgG-t expresszáló

5 A T-sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Naív CD8 + T-sejt Naív CD4 + T-sejt Citokinek (pl. IL-2) Citokinek (pl. IL-2) Nyirokszervek Perifériás szövetek CD4 + Effektor T-sejt CD8 + Effektor T-sejt (CTL) CD4 + Memória T-sejt Aktiváció CD8 + Memória T-sejt Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció

6 B-sejt receptor komplex általi jelátvitel Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció Biokémiai intermedierek Aktív enzimek Transzkripciós faktorok PLC  aktiváció Emelkedett ic Ca 2+ Ca 2+ dependens enzimek Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on membrán adapter fehérje (NTAL)

7 T-sejt receptor komplex általi jelátvitel Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható TCR mediált jelek indítása Biokémiai intermedierek Késői jelátvitel enzimei Transzkripciós faktorok kalcineurin MAP kinázok Diacilglicerol GTP/GDP csere a Ras-on PLC  1 aktiváció Adapter fehérjék T sejt Emelkedett ic Ca 2+ LAT - membrán SLP-76(LCP2) citoplazmás adaptor

8 Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata

9 Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata. pl. Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. A limfociták antigénnel való aktiválása technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi.

10 A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA/ionomicin jelenlétében B sejt T sejt BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák LPS a CD14+TLR4 komplexen keresztül aktiválja a sejteket A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. Az Ionomycin a külső Ca 2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA- val

11 Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai AktivátorT sejt függésIg szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincsvan SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincsvan EBV (transzformáló hatású is) van Anti-Igvancitokinek jelenlétében Egér B sejt LPSnincsvan PWMvan PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincsvan Anti-Ignincscitokinek jelenlétében Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA)lektinCanavalia ensiformis Concanavalin A (ConA)lektinPhaseolus vulgaris anti-CD3Monoklonális ellenanyag

12 Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

13 Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

14 Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab

15 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés -FACS, mikroszkópia, fluorimetria, patch clamp Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul - FRET

16 A jelenlevő vagy termelt „antigének” (fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….) vizsgálata

17 ELISA ELISA plate (lemez) E nzyme L inked I mmune S orbent A ssay lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

18 enzyme linkedimmune sorbent ellenanyaghoz konjugált enzim enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

19 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

20 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer Felület Antigén Primer ellenanyag Jelzés Szekunder ellenanyagok egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység

21 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer (ez is indirekt módszer, és a leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Antigén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyagok A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Enzimek

22 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Antigén Biotinált ellenanyag Avidin Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotin enzimComplexek (arányok!!! mint a precipitációnál) Jel felerősítése

23 A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat. Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak

24 Leg különfélébb anyagok kimutatása oldatokból (pl. bioaktív anyagok) diagnosztikai / laboratóriumi vizsgálatok: hCG (human coriogonadotropin) terhességi tesztek (vizelet/vérplazma) Tumor antigének kimutatása tumordiagnosztika (vérplazma) EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása (doppingvizsgálat) Citokinek, hormonok kimutatása in vitro sejtkultúrákból / diagosztikaI céllal vérplazmából Élelmiszeripari, vagy környezetvédelmi vizsgálatok szennyvíz/élelmiszer „szendvics” ELISA vagy kompetíciós ELISA (lásd később)

25 Kombinált „szendvics” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz). A nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokintartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása pikogrammos érzékenységű

26 Tumordiagnosztika A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

27 Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20- 30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

28 Antigén specifikus ellenanyagok jelenlétének kimutatása immunizálás eredményének nyomon követése ellenanyag termelő hibridómák megtalálása (monoklonális ellenanyag technika) antigén specifikus ellenanyagokat mutatnak ki sok klinikai vizsgálatban (fertőzések, autoimmun folyamatok - lásd a példákat később) (egyszerű) ELISA

29 egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag kimutatásához az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges antigén kimosása telítés/blokkolás: a szabad plasztikfelület beborítása (aspecifikus fehérjével) felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagokat tartalmazó oldat hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása pl. fehérje antigén, vagy nagy méretű szintetikus peptid antigén tisztítva!, mikrogrammos mennyiségben

30 Fertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia miatt), ezért helyette gyakran inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya primer fertőzésben szenved. Ekkor még csak IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

31 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% - ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50- 75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

32 Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. Antigén IgM IgG anti-IgM anti-IgG Memória válasz Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

33 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása -Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag. A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín

34 ELISA alaptípusok (összefoglalás) egyszerű capture/szendvics antigén Ag specifikus ellenanyag detektor/reporter ellenanyag kompetitív pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigén Ag specifikus capture ellenanyag Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag Ag specifikus ellenanyag kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk) antigén nincs jelen oldott Ag

35 Aspecifikus kitapadásból eredő hiba A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával ELISA hibák Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az

36 Hook effect - fals negatív vagy fals alacsony eredmény ELISA hibák Nagyon magas antigén koncentráció esetén, a jelenlévő szolubilis antigén kompetitálhat a felszínhez kikötöttel. Gyakori lehet nem megfelelően beállított egylépéses imminoasayeknél, vagy nem hatékony/nem elégséges mosási lépések esetén Megfelelően beállított szendvics ELISA A túl magas antigén koncentráció, vagy nem megfelelő mosási lépések miatt, a jelenlevő szolubilis antigénhez kötődnek a jelzett ellenanyagok, ami fals negatív vagy a valósnál alacsonyabb eredményt ad 0 (kompetitív ELISA esetében ez nem fordulhat elő – diagnosztikában ezért gyakoribb)

37 Elkészült ELISA lemezek

38 pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak! Diagnosztikai gyorstesztek:

39 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal nitrocellulóz membrán jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) elölnézet oldalnézet hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv abszorbciós rész (cellulóz, papír) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

40 hCG csapda ellenanyag sáv kontroll ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít

41 hCG sáv ( kikötött hCG) kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG Ugyanez kompetitív rendszerben A kompetitív ELISA elve hasonló

42 Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása

43 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Elve hasonlít az ELISA-hoz Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. Érzékenység: kb. 1 per 300 000 sejt Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között végzik.

44 ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol ) (aktiválás, inkubáció) - mosás A citokin termlő sejt helyét mutató folt Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal A mérés menete

45 Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

46 A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja Egy spot mérete arányos a sejt által termelt ellenanyag vagy citokin mennyiségével A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

47 Sejtes ELISA Sejtfelszíni, vagy sejten belüli antigének kimutatására Letapadó sejtek a tálcákon növeszthetőek Nem letapadó sejtek ráfixálhatók v. poly-L-lizinnel előkezelt felületre rögzíthetők Különféle sejtfelszíni antigének Intracelluláris antigének Szinreakció arányos a mennyiségükkel Szignalling foszforilált/nem foszforilált jelátvivő molekulák relatív aránya ( két színű ELISA - 2 különböző enzim és szubsztrát vagy eltérő színű fluoreszcens/lumineszcens festékek)

48 Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 10 6 sejt szükséges a vizsgálathoz

49 A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy pl. anti-foszfotirozin ellenanyaggal a foszforilált fehérjék sávja) A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át (PVDF, nirocellulóz)

50 Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik: enzimmel konjugált ellenanyag indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok) Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag- epitóp kölcsönhatás alapján Western Blot

51 pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja aktiválatlanConAPHA A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben Y P-Y P-Y P-Y blot

52 A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.

53 Fab Fc Epitóp a protein felszínén Primer ellenanyag Szekunder ellenanyag Torma- peroxidáz Immobilizált proteinek Membrán H2O2H2O2 H2OH2O luminol enhancer h Detektálás Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H 2 O 2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000- szeresére növelhető (enhancer) luminol

54 Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötések alkoholok – vízelvonó szer (szövettípustól és az antigéntől függően) Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp FITC – fluoreszcein izotiocianát PE – fikoeritrin, stb. Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz (a szubsztátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

55 Szövetminta FIXÁLÁS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA „FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel

56 Immunhisztokémia ABC Technika (lásd a korábbi diát is) Secunder antitest Avidin Szövetmetszet Sejtek (sejttenyészetek) Tárgylemez Primer antitest Biotin Enzim X

57 normál hisztokémia (nem immun) Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

58 Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

59 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

60 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

61 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt festés) Autoimmunitás immunfluoreszcens diagnosztikája A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is ki lehet mutatni

62 A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) citokinek - előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4)

63 Eredmény: Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blot-ét (hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

64 Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. Bioassay pl. Wehi 164 sejtek pl. CTLL2 sejtek van IL-2nincs IL-2 van TNFnincs TNF Probléma: Keresztreaktivitások lehetségesek! (pl. IL-2 ~ IL-4)

65 Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL-4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL-2. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl. MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció IL-2 TNF CTLL2 Wehi 164 MTT assay:

66

67 Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca 2+ szint meghatározása A citoplazmatikus Ca 2+ koncentráció növekedése pl. fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható. /Fluo-3 vagy az Indo-1/ példa – intracelluláris Ca 2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre) B sejt T sejt (klikk a képre)

68 módszer: RT-PCR, QRT-PCR A génaktiváció vizsgálata A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható pl. citokin gének aktivációja sejtek  RNS izolálás RNS  (reverz transzkriptáz)  cDNS cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm  SYBR green)

69 Sejtciklus DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3 H-timidin) - transzkripció kimutatása (RT-PCR) - fehérjék kimutatása (Immunoassay, ciklinek, Ki-67) sejtszám változás meghatározása (CFSE) a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció

70 G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 s 0 200 400 600 8001000 G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) DNS mennyiség sejtszám 2N 4N A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl. a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)

71 A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek 3 H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri. Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott (β-bomlás mérése – pl. szcintilláció). A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). Karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter CFSE vagy más hasonló cell tracker festékek alkalmazása.

72 A sejtosztódás meghatározása A „Cell tracer/tracker” festékek megfestik a sejteket vagy bejutnak a sejtekbe, és sokáig megőrződnek. A CFSE (karboxifluoreszcein diacetát szukcimidil észter) apolárossága miatt átjut a sejtmembránon. Az intracelluláris észterázok lehasítják az apoláros acetil csoportokat, és a szukcimidil észter (SE) csoport kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjék amino csoportjaihoz. Amikor a sejtosztódás során a jelzett fehérjék elosztásra kerülnek a 2 utódsejt között, a fluoreszcencia intenzitás a felére csökken. sejtosztódások : 7 6 5 4 3 2 1 0