Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása 8. szeminárium

Szeparáció A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás (jó esetben ez a tulajdonság élő sejteken is megragadható – az élő sejtekkel további vizsgálatok végezhetők) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő (sejtfelszíni) antigének Angolban két szó is van visszanyerésre (theoretical)yield – elméleti érték – a maximálisan kinyerhető sejtek mennyisége/százaléka recovery - téynlegesen kinyert sejtek mennyisége/százaléka Pl. egy mintában100 sejt van, és ezek 60% CD4+ . A szerparálással 60 db sejtet kaphatunk mint yield (elvileg), de csak 50-et (50%) kapunk a folyamat végén (recovery) A percentage yield a kettő aránya ( x 100) Szeparálás eredményességét jelezi: tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága (veszteség) sejtek életképessége

Szeparáció Kétféle alap hozzáállás: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől Pl. a sejtek valamelyik felszíni molekuláját (receptorát!) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük. A sejteket a szeparálási procedúra körülményei mellett a receptorához között ellenanyag direkt módon befolyásolhatja! A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez. negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetében inkább ezt használják.

Ember esetében a vér viszonylag egyszerűen hozzáférhető „alapanyag” az immunrendszer egyes sejttípusainak izolálásához Sejtes elemek egyszerű elválasztása a vérplazmától: Szeparáció szűréssel (egyszerű membrán v. holofiber „membrán”) Pore diameter for plasma separation: 0.2 to 0.6μm Plazma szeparálásához használják

A folyamat centrifugálással gyorsítható A sűrűségkülönbség miatt az alvadás gátolt vér idővel magától is három részre szeparálódik: alul: leülepedett vörösvérsejtek felül: sejtmentes vérplazma a kettő között a vörösvérsejtekre rétegződő buffy coat  fehérvérsejtek és vérlemezkék rétege buffy – buff: The color of buff; a light yellow, shading toward pink, gray, or brown. We spin a tube of anticoagulated blood. The RBCs settle first, they're the densest. The WBCs make a layer or "Coat" on top of the RBCs. The more WBCs, the greater the thickness of the Buffy layer. Note in the case of the leukemia in this picture, there is not only a thickened buffy layer, but the there are fewer RBCs, owing to the anemia associated with the leukemic process. A folyamat centrifugálással gyorsítható

Ha valamelyik alkotót valamilyen célból eltávolítják  Aferezis Aferezis (ógörög, ἀφαίρεσις) -“elvétel” A szeparált komponensen kezelés végezhető és a többi komponenssel együtt visszaadható. Donációs célú aferezis Terápiás aferezis Donor aferezis: Plazmaferezis – feldolgozva (pl.IVIG) vagy friss fagyasztott plazmaként immundefficiens személyeknek vagy akut fertőzésekkor passzív immunizáláshoz Vérlemezkék (trombocitaferezis) – koncentrált formában örökletes vagy indukált trombocitopénia (fertőzések, kemoterápia, besugárzás) vagy trombocita diszfunkció esetén Vörösvérsejtek (eritrocitaferezis) - különféle anémiás betegek számára (örökletes vagy műtéti, baleseti, belső és külső vérzések esetében, sarlósejtes anémia) Leukociták (leukaferezis) – buffy-coat, főként autotranszplantációhoz pl. kemoterápiás kezelést megelőzően a leukociták védelme miatt monociták szeparálásához dendritikus sejt terápia céljára őssejt terápiás célra a csontvelői őssejtek mobilizációja után végzett leukaferezis (ugyanez az autológ és allogén csontvelő átültetés egyik lehetőségeként is szóbajöhet) : Plasmapheresis - blood plasma. Plasmapheresis is useful in collecting FFP (fresh frozen plasma) of a particular ABO group. Commercial uses aside from FFP for this procedure include immune globulin products, plasma derivatives, and collection of rare WBC and RBC antibodies. Erythrocytapheresis- red blood cells. Erythrocytapheresis is the separation of erythrocytes from whole blood. It is most commonly accomplished using the method of centrifugal sedimentation. This process is used for red blood cell diseases such as sickle cell crises or severe malaria. The automated red blood cell collection procedure for donating erythrocytes is referred to as 'Double Reds' or 'Double Red Cell Apheresis.'[1] Plateletpheresis (thrombapheresis, thrombocytapheresis) - blood platelets. Plateletpheresis, like it sounds, is the collection of platelets by apheresis; while returning the RBC's, WBC's, and component plasma. The yield is normally the equivalent of between six and ten random platelet concentrates. Quality control demands the platelets from apheresis be equal to or greater than 3.0 × 1011 in number and have a pH of equal to or greater than 6.2 in 90% of the products tested and must be used within five days. Leukapheresis - leukocytes (white blood cells). Leukopheresis is the removal of PMN's, basophils, eosinophils for transfusion into patients whose PMN's are ineffective or traditional therapy has failed. There is limited data to suggest the benefit of granulocyte infusion. The complications of this procedure are the difficulty in collection and short shelf life (24 hours at 20 to 24°C). Since the "buffy coat" layer sits directly atop the RBC layer, HES (Hydroxyethyl starch?), a sedimenting agent, is employed to improve yield while minimizing RBC collection. Quality control demands the resultant concentrate be 1.0 × 1010 granulocytes in 75% of the units tested and that the product be irradiated to avoid graft-versus-host disease (inactivate lymphocytes). Irradiation does not affect PMN function. Since there is usually a small amount of RBC's collected, ABO compatibility should be employed when feasible. Stem cell harvesting - circulating bone marrow cells are harvested to use in bone marrow transplantation. Plasma exchange - removal of the liquid portion of blood to remove harmful substances. The plasma is replaced with a replacement solution. LDL apheresis - removal of low density lipoprotein in patients with familial hypercholesterolemia. Photopheresis - used to treat graft-versus-host disease, cutaneous T-cell lymphoma, and rejection in heart transplantation. Immunoadsorbtion with Staphylococcal protein A or G -agarose column - removal of allo- and autoantibodies (in autoimmune diseases, transplant rejection, hemophilia) by directing plasma through protein A-agarose columns. Protein A is a cell wall component produced by several strains of Staphylococcus aureus which binds to the Fc region of IgG. Leukocytapheresis - removal of malignant white blood cells in people with leukemia and very high white blood cell counts causing symptoms. Thrombocytapheresis - removal of platelets in people with symptoms from extreme elevations in platelet count such as those with Essential Thrombasthenia or Polycythemia vera

Terápiás aferezis: Vér abnormális oldott vagy sejtes komponensének eltávolítása Diszfunkcionális komponens eltávolítása és helyettesítése az egészséges donor aferezis termékeivel Vér komponensének megváltoztatása (ex vivo terápia) Leukaferezis – leukémiák esetében az extrém magas fehérvérsejtszám hemosztázis problémákhoz vezethet (nehéz légzés, látás zavarok), krónikus gyulladásos megbetegedéseknél csökkenthető vele a gyulladásos sejtek száma (colitis ulcerosa, rheumatoid arthritis) LDL aferezis – pl. familiáris hiperkoleszterinémia esetében (ApoB affinitás oszloppal, vagy acetátos kémiai precipitációval) Trombocitaferezis – esszenciális trombocitémia/trombocitózis esetén (trombózisok és vérzések) a diszfunkcionális magas trombocitaszám gyors csökkentése, az életveszély elkerülésére Eritrocitaferezis - pl. sarlósejtes anémiában sarlósejtes krízis felléptekor a rendellenes vvs-ek eltávolítása/cseréje Plazmacsere – autoimun betegségekben, az autoellenanyagokat tartalmazó plazma eltávolítása, és helyettesítése (immunszuppresszióval kombinálva) (pl. Myasthenia gravis, Guillain-Barré szindróma, lupus, Goodpasture szindróma, Antifoszfolipid antitest szindróma, Behcet szindróma, stb….) Immunadszorpció protein A v. G oszloppal – auto- vagy allo-ellenanyagok eltávolítása a plazmából autoimmun-, transzplantációs kilökődési- esetleg hemofíliás zavarokban protein A v. protein G oszlopon keresztül vezetéssel Essential thrombocytosis - The major symptoms are bleeding and thrombosis. Platelets derived from the abnormal megakaryocytes do not function properly, which contributes to the clinical features of bleeding and thrombosis. ApoB – apolipoprotein B az LDL-re jellemző fehérje

Folyamatos áramú aferezis rendszerek Continuous Flow Centrifugation (CFC) Folyamatos áramú centrifugálás Fcf Fcf A vér folyamatosan áramlik befelé, szeparálódnak a frakciók és folyamatosan távoznak a szétszeparált frakciók. aferezis és változatai: http://en.wikipedia.org/wiki/Apheresis http://www.transfusionmedicine.ca/articles/buffy-coat-component-production-method Régi típusú mosható/újra felhasználható aferezis centrifuga betét keresztmetszeti képe Megfelelő centrifugálási módszerrel trombociták és trombocita mentes plazma is kinyerhető

Eldobható, steril műanyag betétes centrifugák Single Stage Channel (egy szeparációs terű) Plasma Line WB Line RBC, WBC, PltLine

Detail of Single Stage Channel A kontrol line segítségével valószínűleg fotometrikusan figyelik a kilépő folyadékot és (automatikusan) szabályozzák az elfolyás sebességét (Avvt és a plazma réteg között van az elfolyás, onnan vesz mintát. Ha pl. ha túl sok vvt van benne, gyorsítja a vvt elfolyást, ha sok a plazma fokozza a vér betáplálást/csökkenti a plazma elfolyást/csökkenti a vvt elfolyást)

Dual Stage Separation Channel for plasma and platelet separation Second Stage (kettős szeparációs terű, plazma és trombocita szeparálására is alkalmas) Platelet out Plasma out whole blood in A kontrol line segítségével valószínűleg fotometrikusan figyelik a kilépő folyadékot és (automatikusan) szabályozzák az elfolyás sebességét (Avvt és a plazma réteg között van az elfolyás, onnan vesz mintát. Ha pl. ha túl sok vvt van benne, gyorsítja a vvt elfolyást, ha sok a plazma fokozza a vér betáplálást/csökkenti a plazma elfolyást/csökkenti a vvt elfolyást) Control Line (lásd a megjegyzésben) RBC Line First Stage

Vérplazma előállítása szűréssel Vérplazma, vörösvérsejt készítmény és buffy coat előállítás folyamatos áramú centrifugálással Vérplazma előállítása szűréssel & WBC Összegyűjtött platelet előállítása buffy coatokból

A vérből ilyen módon szeparált fehérvérsejtek még túl „szennyezettek” vörösvérsejtekkel további vizsgálatok számára Ficoll-Paque (1.077g/ml) Ficoll is a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions .

(from Google pictures) (Nature Protocols http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69-F1.jpg)

Ficoll-Paque sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) neutrofil granulociták Ez a differential centrifugation

Percoll – neutrofil granulociták szeparálásához Physical chemical characterization of Percoll. I-III. Laurent, T.C. et al. Colloid Interface Sci. 76, 124–145 (1980). lépcsős vagy folyamatos pecoll gradiensen a neutrofil granulociták is elkülöníthetőek Percoll: The silica in Percoll is a sodium-stabilized colloid, which is polydisperse with particle diameters between 10 nm and 30 nm. Pure silica is toxic to cells and causes hemolysis of red blood cells. The particles are coated with polyvinylpyrrolidone (PVP) to avoid the toxic effect. The density gradient method of separation has advantages over the normal differential centrifugation; there is no mixture of materials beneath the sample zone, cells and particles of the same size, shape and density sediment as separate zones without convection. Selfgenerating gradient technique – continous gradient Romanian J. Biophys., Vol. 14, Nos. 1–4, P. 53–58, Bucharest, 2004

Rozetta képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nemkívánatos sejtek eltávolításához is A az eltávolítandó sejtre, és a vvt specifikus ellenanyag azonos típusú. A sejtekből és ezekből, erre az ellenanyagra specifikus második ellenanyag nagy komplexeket hozhat létre (rozetta). A vvt-k így magukkal viszik ezeket a sejteket is. Lehet ilyen negatív szeparációs kiteket kapni! ÉRDEKESSÉGKÉPPEN Negatív szeparáció

Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása (negatív és pozitív szeparáció) Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

kitapasztott ellenanyagok Ellenanyag ”panning” (negatív és pozitív szeparáció) kitapasztott ellenanyagok

Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS (negatív szeparáció) (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak)

Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől Mágneses sejtszeparálás (MACS) specifikus ellenanyag paramágnesesség – nem mágneses anyag, ami mágneses térben maga is mágnesessé válik (pl. vas) paramágneses szemcse

MACS

Nem jelölt sejtek eltávolítása jelölt sejtek kinyerése Mágneses sejtszeparálás (MACS) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szelekció)

Mágneses oszlop Mágneses oszlop Neodímium mágnes (Nd2Fe14B) legerősebb ismert permanens mágnes.

CliniMACS – zárt rendszerű mágneses sejt szeparátor CliniMACS Plus CliniMACS® Prodigy „coming soon”

A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sejtfunkciókat általában nem befolyásolják                                                                           CD8+ T cells „DETACHaBEAD” DETACHaBEAD is a polyclonal antibody specifically made according to a patent applied invention. The antibody is produced by immunising sheep with Fab fragments made from purified papain digests of mouse immunoglobulin. DETACHaBEAD is the globulin fraction of serum as obtained with 50% ammonium sulphate precipitation. It is supplied in 0.15M phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4, without any preservatives added. No cross reaction with human IgG, IgM or IgA has been detected in quantitative ELISA tests. Valószínűleg anti idiotipus antitestek is vannak benne, ezek kompetitálhatnak az antigénnel „DETACHaBEAD” Az mágneses részecskékkel konjugált ellenanyagok Fab része ellen termeltetett poliklonális ellenanyagokkal (amelyek valószínűleg anti-idiotipus antitesteket is tartalmaznak) elérhető, hogy leváljanak a sejtekről. (kompetíció a sejtfelszíni antigén és az anti-idiotípus ellenanyag között)

elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján PMT 4 Minta PMT 3 Áramlási cella PMT 2 PMT 1 Laser

CD antigén sejttípus funkció ligand T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek A CR2-vel (CD21) és a CD81 -gyel együtt a B sejt antigénreceptor koreceptor komplexe C3d, iC3b  CD21 a felismerő rész CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 Ezek jó része elhangzott/elhangzik az előadások és szemináriumok során. LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de nagyon hatékony opszonin)

B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek válasz a kérdésre: először negatív aztán pozitív szelekcióval limfociták Mágneses szeparálással hogyan lehetne ezt megcsinálni?

Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik A rezgés piezoelektromosságon alapul. Ultrahang frekvenciájú (15-100 kHz). Azonos frekvenciával megvilágítva (stroboszkóp) a rezgésenként képződő cseppek állni látszanak. A cseppképződési pontot befolyásolja a rezgés frekvenciája, amplitúdója, a folyadékáram sebessége, stb. stb... breakoff point

- - - - - - - - - + + + + Lézer vibráció + Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltötté válik. - + - + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + + - + + + - A lézeres detektáláshoz képest a töltés bekapcsolását ennek megfelelően időben annyival később végzi a berendezés, amennyivel később a folyadékáramban levő sejt eléri a csepp-képződés helyét (”drop-delay”). Ez a késleltetési idő, ismerve frekvenciát, a megvilágítás és a csepp-képződési pont közötti távolságot, és a cseppek távolságát (azaz a ”cseppképződés hullámhosszt”) kiszámolható, és a berendezésen beállítható. - - - - - Gyűjtőcső Gyűjtőcső

Szorter vezérlő szoftverének képe. Középtájon (bal képernyő jobb széle) látható a cseppképződés aktuális állapota (stroboszkóp miatt látszanak állni a cseppek) A jobb oldalt a sejtpopulációk és a bekarikázással (kapuzással) kijelölt szeparálandó sejtek (CD123+ PDC szerű sejtvonal szeparálása)

Vége

Folyamatos áramú aferezis rendszerek A stacionárius (fent) és a forgó rész (lent) egymáshoz illeszkedő tárcsájának ábrázolása. (fekete pöttyök – lukak ahol a befolyó vér/elfolyó vérfrakciók csatlakozik) vörösvérsejtek bemenő teljes vér buffy coat (fehérvérsejt gazdag rész) plazma vissza a diához