Eredmény: az összetartozó X,Y magpárok kijelölése NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) Szalontai Gábor 2D NMR: heteronukleáris két-dimenziós eljárások (5. rész, 35 ábra) 2014. november. Az X mag frekvenciája Eredmény: az összetartozó X,Y magpárok kijelölése Az Y mag frekvenciája

Az egy-kötéses heteronukleáris két-dimenziós eljárások lehetséges eredményei Az X mag frekvenciája 1J(13C-1H) ~ 125-215 Hz Az Y mag frekvenciája

Az X mag frekvenciája 2J(13C-1H) ~ 5-15 Hz 3J(13C-1H) Több-kötéses heteronukleáris két-dimenziós eljárások lehetséges eredményei Az X mag frekvenciája 2J(13C-1H) ~ 5-15 Hz 3J(13C-1H) ~ 5-15 Hz Az Y mag frekvenciája

Skaláris csatolásokon alapuló heteronukleáris korrelációk: az X mag detektálása ún. direkt 2D mérésekkel egy-kötéses korrelációk (HETCOR) két- három-kötéses korrelációk (COLOC, FLOCK) J-spektroszkópia (a spin-echo felhasználásával) APT, het2DJ és hom2DJ

Az eljárás alapja: Insensitive Nucleus Enhancement by Polarization Transfer (1D) t= 1/4J 90o 1Hy impulzus 90o 1Hx impulzus t= 1/4J t = 1/4J t = 1/4J 180o 1H lecsatolás 180o 180o 1H impulzus Akvizició +/- x 13C 180o impulzus 13C 90o x impulzus INEPT DEPT pJD = Θ D =(1/pJ)*sin-1(1/n0,5)

A legegyszerűbb HETCOR (2D) eljárás 90o 1Hx impulzus 90o 1Hy impulzus t1 t2 Derome: moduláció t1 alatt: kémiai eltolódás, csatolások Akvizició +/- x 13C 90o x impulzus

A legyszerűbb HETCOR (2D) eljárás eredménye egy 13C-1H magpár esetében 1H-13C csatolás 13C (F2) Ez lenne a kívánatos! 1H (F1)

Egy-kötéses 2D korrelációk (HETCOR) 90o 1H impulzus 90o 1H impulzus (gerjesztés) t= t1/2 D2/2 D2/2 t= t1/2 D1/2 D1/2 1H lecsatolás 180o 180o Derome: 13C 180o impulzus (szén lecsatolás) 180o 180o 13C 90o impulzus (PT lépés) F2 tengely: normál szén spektrum, de a kvaterner szenek hiányoznak! Akvizició +/- x F1 tengely: normál proton spektrum (csökkentett intenzitással)

HETCOR: X, H magpárok azonosítása az X mag detektálásával: D1 és D2 beállítása D1 = 1/2J szerepe: alatta nincs X lecsatolás, tehát működik a polarizáció transzfer! D2 = ~ 0,3 /J (2-2,5 ms az 1H-13C esetre) szerepe: spektrum szerkesztés!

Példák heteronukleáris korrelációkra: egykötéses 13C-1H (direkt X-mérés) HETCOR : ciklosporin 13C

Több-kötéses korrelációk ( 2D eljárás) Elvileg hasonló, de mivel sokkal kisebb csatolásokon alapul (3-15 Hz) ezekhez sokkal nagyobb D1 és D2 szünetek kellenek, amelyek alatt a jel intenzitása erősen csökken (T2)! Megoldás: ha D1 > At1/2 , akkor a COLOC szekvencia, ahol t1 –et a D1 szüneten belülre helyezik. Bónusz : n1 –ben a homonukleáris csatolások nem jelennek meg, csak a kémiai eltolódások modulálják a jelet t1 alatt! At1 a t1 időszak akviziciós ideje!

Több-kötéses korrelációk (COLOC: 2D eljárás) 90o 1H impulzus (gerjesztés) 90o 1H impulzus (PT lépés) t= t1/2 D1- t1 t= t1/2 1H lecsatolás 180o D2 refókuszálás 180o 13C 13C 90o impulzus (PT lépés) mozgó 13C 180o impulzus (lecsatolás) Akvizició +/- x

Probléma: egy 2D kísérlethez még mindig gyenge az érzékenység Megoldás az ún. inverz detektálás, ami egy bő mag (általában, de nem szükségszerűen proton) detektálását jelenti (általában, de nem szükségszerűen) erre a célra átalakított mérőfejen.

két- három-kötéses korrelációk (HMBC) MB= multiple bond Skaláris csatolásokon alapuló heteronukleáris korrelációk: az X mag mérése proton-detektált ún. indirekt mérésekkel egy-kötéses korrelációk Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Heteronuclear Single Quantum Correlation két- három-kötéses korrelációk (HMBC) MB= multiple bond

Heteronukleáris korrelációk koherencia diagramjai és elméleti érzékenységei. (a) és (b) hagyományos eljárások (az X-magot detektálják), (c) és (d) eljárások (proton inverz detektálás történik). Preparation, Evolution, Mixing és Detection a kétdimenziós eljárások már ismertetett szakaszai. Jegyzet: 4.3.6 ábra.

Az inverz és normál mérőfejek tekercs elrendezései normál eset: X-tekercs (belül) H-1 tekercs (kívül) inverz eset: X-tekercs (kívül) H-1 tekercs (belül)

Inverz heteronukleáris korrelációk: tulajdonságok „Bő” mag (1H) detektálás X mag lecsatolás történik Polarizáció-átvitel az X magról a H-ra (az X magnak megfelelő magot detektálunk, de proton érzékenységgel (ez (64/4)x100 -szeres (?) érzékenységnövekedést jelent a 13C-1H pár esetében) Csak a skalárisan csatolt HX párok jelennek meg. Időnyereség: a proton relaxáció a meghatározó. A skaláris csatolási állandó alkalmas megválasztásával „szortírozhatóak„ a megjelenő X magok. Nemcsak egy-kötéses korrelációk jelennek meg, ha a tényleges csatolás eltér a feltételezettől. Az f1 (X) dimenzióban megjelennek a proton-proton csatolások (a passzív JHH csatolások modulálják a jelet t1 alatt).

Heteronukleáris korrelációk: indirekt mérések, több-kvantumos korrelációk (HMQC, elvi séma) A D periódus alatt létrejövő antifázisú 1H mágnesezettséget az első szén impulzus viszi át a csatoló szén partnerre (több-kvantum koherenciák, két (p= +1 +1=2) és zéró-kvantumosak (p=+1 -1=0), jönnek létre), a t1 időszak alatt mind a proton, mind a szén eltolódások modulálják ezeket a koherenciákat, de az aktív JCH csatolások nem. Miután ezek közül csak a szén eltolódásokra van szükségünk az f1 dimenzióban, a proton csatornába helyezett X p impulzus segítségével megszabadulunk az 1H eltolódások moduláló hatásától. Ezután a második szén impulzus visszafordítja a több-kvantum koherenciákat érzékelhető egy-kvantum mágnesezettségeké, amelyek azonban ismét antifázisúak, ezért egy második D szünetre is szükség van, hogy a széles-sávú X-lecsatolást alkalmazni lehessen.

Kifejlődés: proton és szén kémiai eltolódások Proton-detektált egy-kötéses korrelációk (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) = 1/(2JXH) az antifázis megszűnik! 90o (X) polarizáció transzfer (PT) impulzus Kifejlődés: proton és szén kémiai eltolódások t1 ideig 13C 13C (X) lecsatolás 90o (X) polarizáció transzfer (PT) impulzus 1H 90o impulzus (gerjesztés) = 1/(2JXH) az antifázis kialakul! 1H 180o impulzus (refókuszálja a proton eltolódásokat) Akvizició +/- x F2 tengely: normál szén spektrum, de a kvaterner szenek hiányoznak! F1 tengely: normál proton spektrum (csökkentett intenzitással)

Inverz heteronukleáris korrelációk: akadályok 0,55 % 0,55 % 1H spektrumok: a nem kívánt mágnesezettségek kiszűrése a HMQC szekvenciában, az első 13C impulzus inverziójával a szatellitek fázisa is invertálódni fog, fázisléptetés segítségével (az első szén impulzus fázisát 90 fokkal lépdeltetve) kapjuk a-t és b-t, majd ezeket egymásból kivonva c-t. A kivonási maradék azonban még így is jelentős. Derome: 4.3.8 ábra

Térgradiens-segített korrelációs spektroszkópia (p.178. Claridge.) A zavaró 1H-12C vagy 1H-14N jelpárok kiszűrése az összes inverz kísérletben alapvető fontosságú. Térgradiens-impulzusok alkalmazása a szűrésre, HMQC (a) abszolútérték és (b) fázisérzékeny változatok (Ezek a mérések erre a célra kialakított, gradiens tekerccsel ellátott mérőfejet igényelnek.)

Heteronukleáris korrelációk: indirekt mérések, egy-kvantumos korrelációk (HSQC, elvi séma) HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation): mint azt a neve is sugallja, a leglényegesebb különbség az HMQC-hoz képest, hogy ebben az esetben a t1 periódus alatt csak egy-kvantumos 13C koherenciák vannak jelen, az H-X csatolások refókuszálódnak a periódus végére, tehát csak a szén (X) kémiai eltolódás marad mind moduláló hatás és természetesen csak ez jelenik meg f1-ben. A polarizáció-átvitelt a protonokról a szén-13 magokra és vissza két INEPT szekvencia betét valósítja meg.

két- három-kötéses korrelációk (HMBC) MB= multiple bond Skaláris csatolásokon alapuló heteronukleáris korrelációk: az X mag mérése proton-detektált ún. indirekt mérésekkel egy-kötéses korrelációk Heteronuclear Multiple Quantum Correlation Heteronuclear Single Quantum Correlation két- három-kötéses korrelációk (HMBC) MB= multiple bond

Proton-detektált több-kötéses korrelációk nJCH) = 3-9 Hz (Het Proton-detektált több-kötéses korrelációk nJCH) = 3-9 Hz (Het. Multiple Bond Correlation) Antifázisú multiplettek vannak! Adatfeldogozás: abszolútérték! Nincs refókuszáló szünet! 90o X PT impulzus Kifejlődés t1 ideig 13C (X) lecsatolás 13C 90o X PT impulzus 1H 1H 90o impulzus (gerjesztés) = 1/(2nJXH) antifázis kialakul ~ 100 ms !! Relaxáció!! 1H 180o impulzus (refókuszálja proton eltolódásokat) Akvizició +/- x PT = polarization transfer

Bruker szekvencia: hmbc-gp-nd-qf: gradiens segített- nem lecsatolt- abszolút érték

Alkalmazási példák 1H-13C korrelációk 1H-15N korrelációk Izo-kodein (hsqc gp) Porfirin származék (hsqc gp) Ciklosporin Mentol (hsqc gp, hmbc gp) 1H-15N korrelációk Ciklosporin (hsqc gp) Önszerveződő komplexek (hmbc gp) Ru-komplexek

Példák heteronukleáris korrelációkra: 13C-1H gradiens-segített indirekt mérések (HSQC ): izo-kodein ns=12 ni=1k resolution 20 Hz F2 [ppm] 6 5 4 3 F1 [ppm] 120 100 80 60 [ *1e6] 1 2 1.5 mg izo-kodein in CDCl3 HSQC-ge ns=12 ni=1k resolution 20 Hz J=132 Hz 2005.8.17. SzG 14h kodein 1 999 e:\Avance400 HSQC F1 [ppm] 60 80 100 J=132 Hz 120 6 5 4 3 F2 [ppm] 1,5 mg minta, mérési idő = 14 h 1H

Példák heteronukleáris korrelációkra: 13C-1H gp-indirekt mérések (HSQC ): tetrafenil-porfirin F2 [ppm] 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 F1 [ppm] 135 134 133 132 [ *1e6] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 porfirin C-13 - H1 detected NMR in CDCl3 22 mg/0.5 ml HSQC experiment with Z-gradient Sample: 9605 J=132 Hz SzG 2005.8.17. porfirin 1 1 e:\Avance400 HSQC 13C 1J(13C-1H) = 132 Hz 20 mg, mérési idő = 10 h 1H

Példák heteronukleáris korrelációkra: 13C-1H (inverz) detekció HSQC: ciklosporin

Heteronukleáris egy-kötéses korrelációk (hsqc-gradient promoted) 13C-1H: mentol F2 [ppm] 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 F1 [ppm] 70 60 50 40 30 [ *1e6] - 40 - 20 1 2 3 P28= 1000usec menthol 1 1 e:\Avance400 HSQC 1J(13C-1H) = 135 Hz Mérési idő =

Heteronukleáris egy-kötéses korrelációk (hsqc-gradient promoted) 13C-1H: pravastatin (részlet) 1J(13C-1H) = 135 Hz

Heteronukleáris egy-kötéses korrelációk (hsqc-gradient promoted) 15N-1H: formaldehid Minden proton az egyetlen N maggal csatol, ha az 15N! 1H

Heteronukleáris egy-kötéses korrelációk (hsqc-gradient promoted) 15N-1H: ciklosporin 2,3J(15N-1H) = 90 Hz Figyelem: ha nem látjuk az NH jelet a proton spektrumban, akkor elég reménytelen a dolog, hiszen az átvitel nem valósulhat meg pl. kémiai csere vagy gyors relaxáció miatt!! 15N 1H ~ 25 mM, old. benzol-d6 ~ 1 óra alatt

Példák: heteronukleáris több-kötéses korrelációk (hmbc-gradient promoted) 15N-1H: para ligandum ~ 4 mg/0,4 ml CDCl3 Mérési idő ~ 14 óra 2,3J(15N-1H) = 5 Hz

Ajánlott irodalom Szalontai Gábor: Egy- és kétdimenziós NMR módszerek, jegyzet (pdf) 2003. A.Derome: NMR techniques for chemists, Pergamon, Oxford, 1996 T.D.W.Claridge: High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Pergamon, Oxford, 1999 M.H.Lewitt: Spin dynamics, Wiley, Chichester 2002

J-spektroszkópia (a spin-echo felhasználásával) APT, het2DJ és hom2DJ Az eddigiek során már több esetben foglalkoztunk a spin-echo jelenségével, számos impulzus-szekvencia tartalmazott egy vagy több spin-echo-t, elsősorban az evolúciós periódus (t1) alatti kémiai eltolódás függés megszüntetésére, de más célból is. Az alábbiakban néhány olyan alkalmazásról lesz szó, amelyekben a spin-echo-k képezik a szekvencia alapját, összefoglaló néven gyakran J-spektroszkópiának is nevezik ezeket az eljárásokat. A 2D spektroszkópia korai időszakában (1980-as évek) ezek az érdeklődés középpontjában voltak, azóta ez a helyzet némileg változott, de még mindig számos olyan feladat van, amelyek megoldásában igen előnyösen alkalmazhatók.

Heteronukleáris J-modulált spin-echo Kifejlődés t ideig Kifejlődés t ideig Akvizició +/- x 90o 13C impulzus (x) py 1H csatorna Szélessávú lecsatolás 1H 180o impulzus

Vektordiagram: heteronukleáris J-modulált spin-echo 4.4.1.1 ábra. Spin-echo kifejlődése egy AX (a) és egy AX2 (b) spinrendszer esetében. Mivel a szétterülés frekvenciája kétszeres az utóbbiban, a t időszak végén létrejövő echo jel fázisa 180 fokkal eltér az AX echo-étól. APT: egy alternatív megoldás a J-modulációra (kapuzott lecsatolás) (szintén az AX rendszer esetén) .

Heteronukleáris J-modulált spin-echo: különbség spektrumok