HLA ellenes antitestek szűrése és nyomonkövetése Dr. Tordai Attila Transzplantációs Immungenetikai Laboratórium vezetője Országos Vérellátó Szolgálat, Budapest
HLA-ellenes antitestek szűrése és nyomon követése Tordai Attila Országos Vérellátó Szolgálat Transzplantációs Immungenetikai Laboratórium XVIII. Debreceni Nephrológiai Napok, 2013. 06. 01.
Tartalomjegyzék A HLA-labor lehetőségei a szervtúlélés javításában: Logisztika (CIT-csökkentés); A HLA-egyezés javítása (HLA-tipizálás); HLA-ellenes antitest szűrés, azonosítás; Transzplantáció modellezés (keresztpróba); A kilökődés immunológiai hátterének vizsgálata; Változások az Eurotransplant-csatlakozás után. 3
A hideg ischémiás idő csökkentése a sürgősségi kivizsgálás átszervezésével
A sürgősségi tevékenységek összehasonlító folyamatábrája
A hideg ischaemiás idők (CIT) összehasonlítása régi rendszer utolsó 10 éve (2000.jan.1-2010.okt.31.) (régió: B, D, S, P) utolsó 10 hónapja (2010.jan.1-2010.okt.31.) új rendszer első 10 hónapja (2011. jan.1-2011. okt.31.) átlag (óra) 18,7 ± 3,9 16,5 ± 3,5 12,4 ± 3,2 esetszám (db) 1673 114 91 p<0,001 p<0,001 CIT2 régi rendszer utolsó 10 éve (2000.jan.1-2010.okt.31.) (régió: B, D, S, P) utolsó 10 hónapja (2010.jan.1-2010.okt.31.) új rendszer első 10 hónapja (2011. jan.1-2011. okt.31.) átlag (óra) 21,7 ± 4,0 19,8 ± 3,4 16,0 ± 3,8 esetszám (db) 1155 95 81 p<0,001 p<0,001
HLA-ellenes antitest szűrés, azonosítás
Miért foglalkozunk a HLA-ellenes antitestekkel? TX előtt a preformált (vetélés/szülés, transzfúzió, korábbi TX) antitestek hiperakut rejekciót okozhatnak; TX után antiest-mediált rejekciót okozhatnak. MEGELŐZÉS NYOMON KÖVETÉS
Az antitest-kimutatás evolúciója CDC ELISA Flow/Luminex multi-Ag beads Virtual XM FC Lymphocytes AHG-CDC Flow/Luminex/ELISA single-Ag and Donor-specific 9
Komplement-dependens citotoxicitás (CDC) Terasaki & McLelland: mikro-lymphocyto-toxicitás tipizálásra: 1964:HLA-A,-B,-C 1977:HLA-DR 1984:HLA-DQ 2013:múzeumban. Elve: Sejtpermeabilizáció következik be, ha a HLA sejtfelszíni antigénhez egy arra specifikus, komplement aktivációra képes HLA-ellenes antitest kötődik. A pozitivitás viabilitási festékkel jeleníthető meg. Terasaki-tálca: 1 µl szérum!!!! Alkalmas: (i) antigén-meghatározás (tipizálás); (ii) antitest-kimutatás; (iii) keresztpróba.
A CDC-teszt mikroszkópos képe Negatív Pozitív
HLA-ellenes antitest szűrés CDC-vel – panel reaktív antitestek (PRA) A beteg HLA ellenes antitest-előfordulási gyakorisága %-ban kerül meghatározásra ismert HLA típusú paneltagok limfocitáival (szűrősejtek) szemben. pozitív negatív PRA = 92% A számszerű eredményt befolyásolja, hogy milyen gyakori antigén ellen termelődik antitest.
LUMINEX xMAP technológia Áramlási citometria + szendvics ELISA LUMINEX xMAP technológia A két festék (vörös és infravörös) eltérő arányú keveréke 100-féle gyöngytípust eredményez egyedi spektrális kóddal. Egy reakcióban egyszerre elméletileg 100 féle analit is vizsgálható.
HLA-ellenes antitestek kimutatása szolid fázisú (LUMINEX) technikával Recipiens savó; ismert HLA- antigéneket tartalmazó gyöngyök; Fluoreszcens festékkel konjugált másodlagos antitest (anti-humán IgG).
HLA-ellenes antitest szűrés (LABScreen mix)
HLA-ellenes antitestek azonosítása (single antigen) LABScreen Single Antigen HLA I. osztály
HLA-ellenes antitestek azonosítása (single antigen) LABScreen Single Antigen HLA II. osztály Donor: DR9,14 DR52,53 DQ9,7
Transzplantáció modellezés (keresztpróba)
Keresztpróba (cross-match, XM) Kérdés: van-e a recipiens szérumban a donor sejtekre specifikus antitest. Technika: CDC – komplement aktiváló antitestek; FACS (áramlási citométer) – nemcsak komplement aktiváló antitestek, de érzékenyebb. Célsejtek: perifériás vér mononukleáris sejtek vagy lép/ny.cs. sejtek (cadaver).
A kilökődés immunológiai hátterének vizsgálata
Tx előtt Tx után Donor-specifikus antitest (DSA) Recipiens antitest-profil SA módszerrel + Donor lehető legrészletesebb (6 lokusz) HLA-tipizálása Tx előtt Hiperimmunizált betegeknél tolerálható antigének előzetes azonosítsa (acceptable mismatch, AM program); Már transzplantált betegnél DSA nem mindig jelenik meg valamennyi donor-antigénnel szemben – retranszplantáció esélyének növelése; Élő donoros átültetésnél megfelelő donor kiválasztás – „paired donation”. A DSA, ill. nem DSA anti-HLA antitestek elkülönítése + mennyiségi/aviditási információ (átlagos fluoreszcencia intenzitás – MFI); Ha új DSA jelenik meg, vagy nő a DSA-MFI – rossz prognózis; Ha DSA eltűnik vagy csökken a DSA-MFI – eredményes terápia. Tx után 21
A pre-TX donor specifikus antitestek hatása a graft-túlélésre Lefaucheur 2010. J Am Soc Nephrol 22
Antitest-mediált rejekció (AMR) Lefaucheur 2010. J Am Soc Nephrol AMR nélküli alcsoport n=370 Lefaucheur 2010. J Am Soc Nephrol 23
A single antigen (SA)-vizsgálat lehetőségei Nagy immunológiai kockázatú betegeknél; Deszenzitizációt követően az antitest újratermelődés kimutatására; Immunológiai rejekció gyanújakor; Rejekció elleni terápia nyomon követésére. Hátrányok Túlzott érzékenység – esetlegesen klinikailag nem jelentős antitestek; A nem komplement-aktiváló antitesteket is kimutatja (fagyasztva tárolt cadaver sejtekkel utolagos XM-mel eldönthető; A reagens (gyöngyök) antigén-készlete nem tükrözi a helyi populációra jellemző HLA-eloszlást; Nem ismert a gyöngyökhoz kötött antigének sűrűsége és konformációja; Költséges. 24
Változások az Eurotransplant-csatlakozás után 25
A cadaver vese TX program sajátosságai ET-tagként Speciális programok: (i) gyermek; (ii) acceptable mismatch (AM); (iii) sürgősségi; EFI-akkreditált HLA-labor (jelenleg Bp, később Debrecen); Részvétel az ET szisztematikus mintacsere programjaiban; A recipiens adatokat a TX-centrumok, a HLA-adatokat pedig a HLA-labor rögzíti az ENIS-programba; Szerv-allokáció az egységes ENIS-program (Leiden) által; Szérumgyűjtés a listán levő betegektől 3 havonként, immunizált betegek mintáinak küldése 30 ET-laborba; Törekvés az antitest-profil részletes előzetes megismerésére – virtuális keresztpróba; Új vesebetegek: kétszeri mintaküldés 2 hét időközzel, folyamatos listára kerülés.