Orvos és Egészségtudományi Centrum, Klinikai Kutató Központ Antitrombin III, heparin kofaktor II Muszbek László Debreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi Centrum, Klinikai Kutató Központ

Mi utal thrombophiliára? 1/ Mélyvénás thrombosis relatíve fiatal korban (<55 év) 2/ Recurrens thrombosis 3/ Thrombosis szokatlan helyen (nem alsó végtagon) 4/ Familiáris elôfordulás (öröklött thrombophilia)

Thrombophiliák felosztása 1/ Öröklött 2/ Szerzett 3/ Öröklött + szerzett

Öröklött thrombophiliák okai Az inhibitor rendszer deficienciája Antitrombin III deficiencia Az inaktivátor rendszer deficienciája Protein C, Protein S deficiencia Fokozott faktor szint vagy abnormális faktorok Aktivált protein C resisztencia (FV Leiden) Protrombin 20210A allél Dysfibrinogenaemia thrombosissal Magas FVIII, FIX, FXI szint ? Csökkent fibrinolítikus aktivitás Plazminogen deficiencia, FXII hiány? Egyéb Homocystinuria

A vénás thrombosisokra való fokozott hajlam genetikai okainak relatív gyakorisága 40% 35% 10% 5% APC rezisztencia - FV Leiden Ismert, ritka thrombophiliák AT III, protein C, protein S def. Protrombin 20210 A allél Ismeretlen

Az AT III sémás szerkezete Asn96, 135, 155, 192 SZH N- -C Heparin-kötö helyek Trombin gátlás Ms.: 58.000 D -AT III (90%) (15% szénhidrát), -AT III (10%) -AT III szorosabban kötődik a heparinhoz és a heparan szulfát proteoglikánhoz (HSPG), mint az -AT III , gyorsabbal eliminálódik a keringésből, de több van az érfalhoz kötve.

Antitrombin III gén 1q22-25, 7 exon és 6 intron, 13.480 bp. 700 bp gén promoter, májspecifikus transzkripciós faktorok (HNF3, HNF4) kötôdése 32 aminósav vezető szekvencia, 432 aminósav érett fehérje

Az antitrombin III funkciója Serpin, de progresszív inhibitor, a gátló hatása heparin vagy HSPG jelenlétében 1000x-re gyorsul Fő fiziológiás hatása: a trombin és FXa gátlása (de gátolja a FIXa-t, a FXIa-t a FXIIa-t és a FVIIa-SzF komplexet is) Az aktivációs komplexben a thrombocyták felszínén lévő FXa-t vagy a fibrinhez kötött trombint az AT III még heparin jelenlétében sem gátolja, az alvadékból kikerülő szabad trombint/FXa-t viszont hatékonyan gátolja (“scavanger funkció”). AT III-trombin (TAT) és AT III-FXa komplex gxorsan eliminálódik a keringésből (döntően a máj veszi fel, LDL receptor-related protein)

Heparin-AT III kölcsönhatás Heparin: szulfatált glükózaminoglikán Nem frakcionált heparin: 7-25.000 D Az AT III-mal való kölcsönhatásban döntő a szulfatált pentasaccharid egység (HPSPG-ben is ez van) Magas és alacsony ms-ú frakciók. Alacsony ms.-ú heparin a nem frakcionált heparin kémiai vagy enzimatikus hasítással (1,8-12.000 D) Trombin gátláshoz legalább 18 saccharidból álló molekula. Anti-FXa:anti-trombin hatás aránya nem frakcionált: 1:1 alacsony ms.ú 2:1-4:1 pentasaccharid (fondaparinux): trombinra nem hat

Heparin hatása az AT III-ra antitrombin + pentaszacharid antitrombin 1-antitripszin

Az antitrombin III hatásmechanizmusa Alacsony ms.-ú heparin Heparin nélkül FXa TR TR AT H FXa AT Konvencionális heparin AT TR H FXa

AT III meghatározás I. Funkcionális tesztek Heparin kofaktor meghatározás Progresszív antitrombin meghatározás 1. Alvadási tesztek 2. Kromogén tesztek Antitrombin aktivitás meghatározás Anti-faktor Xa teszt II. Antigén meghatározás Turbidimetria, Nefelometria III. Heparin kötôdés kémiai vizsgálata

Heparin kofaktor aktivitás meghatározás kromogén szubsztráttal Heparin + AT III  Heparin - AT III komplex trombin (feleslegben)  Heparin - AT III + ————————— FXa (feleslegben)   Heparin - AT III - trombin + trombin (maradék) —————————————————————  Heparin - AT III - FXa + FXa (maradék) trombin R-pNA ———— R-COOH + pNA FXa Rtr CBZ-Gly-Pro-Arg Rxa: Bz-IIe-Glu-Gly-Arg

AT III meghatározás problémái Szűrőteszt: funkcionális kromogén teszt Az anti-trombin alapú teszt hátránya: nem specifikus, heparin kofaktor II-t is beleméri ha bovin trombin akkor jobb Anti-FXa alapú tesztet a heparin kofaktor II nem befolyásolja Szűk referencia tartomány (80-120%), a döntés a 65-80%-os tartományban nagyon nehéz és súlyos következményekkel jár. Többszöri mérés, genetikai teszt

Öröklött antitrombin III hiány laboratóriumi típusai Típus Antigén Heparin kofaktor Progresszív Heparin aktivitás aktivitás affinitás* Ia    Normál Ib    Csökkent IIa Normál   Csökkent IIb Normál   Normál v. emelkedett IIc# Normál  Normál Csökkent * Heparin kötô teszttel meghatározva # IIc típusú heterozigóták: nincs fokozott thrombosis rizikó, öröklôdésmenet AR

Antitrombin III hiány Öröklésmenet: AD (II/HBS: AR) Gyakoriság: 1:2000-5000 A thrombophila oka: 3-5% Thrombosis rizikó (OR) 21, 5 Plazma szint heterozig.: 30%-70% A heterozigóták tünetei: DVT, PE, MVT, CVT I. típus és II/RS, II/PE típus esetén nincsenek homozigóták : letális mutáció II/HBS esetén csak a homozigóták betegek Spanish multicenter (family) study on thrombophilia  Leiden thrombophilia study (general population)

Öröklött antitrombin III hiány típusai I. Típus: Alacsony antitrombin aktivitás és antigén II. Típus: Abnormális antitrombin variáns RS, az aktív centrumra gyakorolt hatás (382-402; Arg393-Ser394: trombin hasítási hely) HBS, a heparin kötô helyre gyakorolt hatás PE, pleiotróp (multiplex) hatás (402-429)

Antitrombin gén mutációk altípusonként Fajta Összesen I. Típus: 92 113 II. Típus: RS 12 55 HBS 12 70 PE 11 18

Debrecenben talált AT III mutációk P41L L99F G392D R47H V295V Q305Q Asn96, 135, 155, 192 SZH N- -C Heparin-kötö helyek Trombin gátlás P41L: AT III Basel (BA) R47H: ATIII Padua I, ATIII Rouen I, ATIII Bligny(KM) L99F: AT III Budapest 3 (FK, HM, SJ, BJ, RK, GE, KSGY) G392D: AT III Stockholm (KMP)

Beteg AT III aktivitás (%) AT III antigén (g/L) Mutáció Referencia KMP 52 0.27 Gly392Asp heterozigóta 1AT III Stockholm FK 58 0.26 Leu99Phe heterozigóta 2AT III Budapest 3 HM 0.24 SJ 56 0.22 BJ 24 0.19 Leu99Phe homozigóta RK 57 0.28 GE 61 KSG 27 0.20 BA 67 0.31 Pro41Leu heterozigóta 3AT III Basel KM 75 0.29 Arg47His heterozigóta 4AT III Padua I SzI 46 0.21 Nem detektálható Referencia tartomány: Antitrombin III aktivitás: 80-120%,Antitrombin III antigén:0.19-0.31 g/L 1Blajchman et al. Blood, 1992; 79: 1428-34. 2Olds et al.FEBS Lett, 1992; 300:241-6. 3Chang and Tran, JBC, 1986; 261:1174-6. 4Owen et al. Blood, 1987 ; 69:1275-9., Caso et al. Thromb Res, 1990;58:185-90. Wolf et al. Thromb Haemost, 1990;63:215-9.

Blajchman et al. Blood, 1992, 79: 1428-34. Antithrombin III-Stockholm: A codon 392 (Gly-Asp) mutation with normal heparin binding and impaired serine protease reactivity Blajchman et al. Blood, 1992, 79: 1428-34. 26 éves nőbeteg OAC+MVT Beteg plazma és kontroll plazma Heparin-sepharose oszlopon azonos elúciós profil, SDS-PAGE-n azonos mobilitás Beteg és kontroll plazmából izolált AT III humán trombinnal inkubálva a beteg AT III nem alkot TAT komplexet Site-directed mutagenesis- sejt mentes fehérjeszintézis: normál AT III 15 sec alatt, beteg AT III csak 5 perc után alkot TAT komplexet Heparin hozzáadása fokozta a TAT képződést  Az AT III RS variáns oka a trombin AT III aktiv centrumának fel nem ismerése

AT III Budapest 3- családvizsgálat Beteg Tünetek AT III aktivitás (%) AT III antigén (g/L) Mutáció SN Tricuspidalis billentyű thrombosis 40 0.21 Leu99Phe homozigóta SK tünetmentes 56 Leu99Phe heterozigóta SGY VCI thrombosis 25 0.19 SGY (apa) 64 0.28 RA (anya) 72 0.26

Szerzett AT III deficienciák Csökkent szintézis Consumptio Leukocyta proteázok elhasítják az reaktív hurkot Máj elégtelenség Súlyos sepsis Trauma, égés Malignus megbetegedések kemoterápia) Extracorporális keringés Nephrosis syndroma Acut DIC

Heparin kofaktor II Szintén serpin (66.000 D), 33% homológia az AT III-mal Csak a trombint gátolja, egyéb aktív alvadási faktorokat nem. Szintén progresszív inhibitor, a heparin és a dermatán szulfát fokozza a hatását Más a hatásmechanizmus mint az AT III esetében Az aktív centrumban leucin van, amely mellett a trombin nem hasít (katepszin G-t, kimotripszint gátol a serpin mechanizmussal) Nem a trombin aktív centrumához, hanem az exosite 1-hez kötődik Hetrozigóta deficienciája nem okoz thrombophiliát