Az immunrendszert célzó terápiák: Stimuláció Szuppresszió Moduláció

Az immunfolyamatok szabályozása A SEJTEK ÉRÉSE SCF citokinek Tímusz IL-7 IL-15 Csontvelő IL-3 IL-4 IL-5 IL-9 GM-CSF GM-CSF

Az immunfolyamatok szabályozása FELISMERÉS a felismerő készlet alakulása T-sejtek tímusz extratimikus érés belső környezet naív T B-sejtek csontvelő naív B TD TI rövid életű plazmasejtek hosszú életű külső környezet klonális kiterjedés (immunválasz) T-effektorok T-memória ELLENANYAG KÉSZLET IgM IgG,IgA,IgE B1-sejtek IgM anti-idiotípus ellenanyagok reumafaktorok

Az immunfolyamatok szabályozása EFFEKTOR FOLYAMATOK Ellenanyag osztály, alosztály megoszlás  FcR  fagocitózis, ADCC komplement aktiváció komplement aktiváció IgG és IgE közvetített ADCC

Az immunfolyamatok szabályozása EFFEKTOR FOLYAMATOK gyulladási citokinek

Az immunfolyamatok szabályozása EFFEKTOR FOLYAMATOK citokin egyensúly

adhéziós és kostimulációs molekulák (ligandumok) sejtek, sejtek és az antigén felismerés BCR / TCR (jelátvivő láncok, koreceptorok) adhéziós és kostimulációs molekulák (ligandumok) sejtek, sejtek és az extracelluláris mátrix közötti „kommunikáció”, homing, aktiváló vagy gátló jelek FcR CR Ag-EA ill. Ag-(EA)C immunkomplexek kötődése  aktiváló vagy gátló jelek citokinek és receptoraik sejtek, sejtek és az extracelluláris mátrix közötti„kommunikáció”, homing, sejtműködés szabályozása, aktiváló vagy gátló jelek MHC a antigénből származó peptidek kötése és bemutatása TOLLR/ PRR patogénekre jellemző szénhidrát motívumok felismerése  endocitózis, fagocitózis, aktiváció

A BCR komplex L H H L Variábilis ( V ) Konstans ( C ) Transzmembrán domén sejtmembrán a b a jelátvitelért felelős járulékos láncok: Iga, Igb

Az Ig hipervariabilis régiói CD: complementarity determining region

A pre-TCR és a TCR szerkezete

MHC I MHC II

Az MHC I szerkezete és a hozzá kötődő molekulák calreticulin peptid-kötő árok peptid-szállító fehérje komplex b2 mikroglobulin CD8, tapasin

Az antigénprezentáció endogén útja A nagy affinitással kötődő peptidek stabilizálják a molekulát, ami a Golgi-rendszeren át a felszínre jut 4 Az a lánc a calnexin chaperon fehérjéhez, majd a b2m hez kötődik. Igy alakul ki az MHCI megfelelő konformációja a peptidkötéshez 3 MHCI molekulák a lánca és a b2m az ER-ban szintetizálódik 2 A peptideket az endogén fehérjékből a proteaszóma állítja elő és a TAP „pumpálja” az ER-ba. 1

Az antigénprezentáció exogén útja Az li hasítási termékét, a CLIP-et egy erősebben kötődő peptid szorítja le Az li a korai endoszmába irányítja az MHCII molekulát A két lánc párosodását az invariáns lánc (li) chaperon biztosítja és egyben gátolja a peptidek kötődését MHCII molekulák a és b lánca az ER-ban szintetizálódik

Immunterápiás eljárások / az immunrendszer működésének módosítása -tumorsejtek elleni válasz elősegítése -kórokozók elleni válasz elősegítése Immunstimuláció Immunszuppresszió -autoimmun folyamatok gátlása -allergiás folyamatok gátlása -transzplantációs tolerancia létrehozása -az újszülöttkori hemolítikus betegség kialakulásának megakadályozása Immunmoduláció -a TH1 / TH2 egyensúly eltolása autoimmun vagy allergiás kórképekben -az ellenanyagválasz izotípus megoszlásának megváltoztatása allergiás kórképekben

A FERTŐZÉSEKKEL SZEMBENI VÉDELEM a fertőzést követően  hagyományos gyógyszeres (antibiotikumok, vírus anyagcsere gátlók) passzív immunizálás (ellenanyagok, sejtek) aktív vakcinálás a fertőzést megelőzően  vakcinálás  a specifikus felismerő készlet arányának növelése specifikus immunológiai memória létrehozása

IMMUN STIMULÁCIÓ -vakcináció Fertőző betegségek, járványok Edward Jenner, 1796, himlő „A landmark was discovery of the germ theory, which included small parasites, bacteria and viruses. This theory was mainly based on the studies of Robert Koch (1843-1910), Louis Pasteur (1822-1895) and many others.”

Európa első oltással foglalkozó kórháza Londonban 1750-1800

. . . . ezen egészségtámogató eszközökkel összhangzó egészségápolási szabályok teljesen elegendők a himlőragályozástól való megóvásra, és azért is a mesterséges himlővel való beoltás nemcsak fölöslegesnek tűnik fel, hanem az egyúttal a természet törvényeivel ellenkező kihágásnak tekintendő. Az emberi vagy állati vérből nyert genny beoltásával különböző betegségek csírái terjesztetnek széjjel, melyek lényegesen hozzájárulnak az emberi nem degenerátiójához’’   ” Van-e az oltásnak a természet törvényei szerint létjogosultsága? Isten ments ! ” Bilz F. E.: A természetes gyógymód, 1905

Karikatúra az E. Jenner által bevezetett himlő oltás következményeiről

Az immunválasz manipulálása: az immunválasz befolyásolásán alapuló terápia Antigén specifikus Immunstimuláció Immunszuppresszió Nem antigén specifikus Immunstimuláció Immunszuppresszió Immunmoduláció

Célpont: az immunválasz elemei: citokinek, adhéziós molelulák, sejtmembrán molekulák, receptorok, ellenanyagok Ellenanyagok mint gyógyszerek: specifitás  antigenicitás humanizált ellenanyagok, „targeting”

Antigénspecifikus immunstimuláció: Aktív immunizálás: elölt kórokozó legyengített kórokozó keresztreaktív, nem patogén élő kórokozó, vagy ennek része nem toxikus, módosított forma (mikrobiális toxin) Eredmény: ellenanyag termelés + effektor T sejtek memória válasz   Adjuvánsok: ag koncentrálása hosszú ideig fenntartása APC stimulálása a szervezet specifikus védekező képességének fokozása

  Passzív immunizálás: hiperimmunizált állatból vagy emberből IgG –kész antigénspecifikus ellenanyag előnye: gyors, de átmeneti hátránya: nincs memória válasz, az ellenanyag eliminációja, neutralizáció, allergia, fajspecifikus immunválaszt válthat ki   alkalmazás: tetanusz, kígyóharapás humán IgG: ellenanyag defficiencia Adaptív immunitás: immunkompetens sejtekkel történő terápia -gyermekkori immundeficienciák: Kongenitális sejtes immundefficiencia forrás: csontvelö (MHC kompatibilis), vagy fötális máj, timusz immunkompetens sejtjei -enzimhiányos betegségek: adenozin deamináz, nukleozid foszforiláz szomatikus génterápia: csontvelői őssejtbe bejuttatott virális vektor, mely a kívánt hiány-gént tartalmazza.

Vakcináció –antigén specifikus immunstimuláció Oltóanyag: Kórokozó, vagy általa termelt fehérje pl. toxin  ellen Élő, legyengített vírus hatékonysága  elölt vírusé  (effektor mechanizmusok, CD8+T sejt szám )   Rekombináns DNS technológia Immunizálás dendritikus sejtek segítségével –új típusú vakcinák- a jövő Kórokozó legyengítése: sejttenyészetben szaporított vírus, ahol eredetileg nem nő (majom)  mutációk  vírus szaporodása  emberi sejtekben nem szaporodik  - oltóanyag In vitro mutagenezis: virus gén megváltoztatása visszafordíthatatlanul pl. influenza- évente más - antigén shift tervezett mutagenezis

Vírusok legyengítése nem emberi sejtekben való tenyésztéssel

Patogén vírus Virulencia gén izolálása Virulencia gén mutációja vagy eltávolítása

Nem patogén mutánsok kifejlesztése: a virulenciához szükséges gén eltávolítása Salmonella typhi: UDP galactóz epimeráz mutáció  LPS szint csökken   Targeting: aromás aa bioszintéziséhez szükséges enzim mutációja  Tyr, Phe szintézis nincs  ezért cssak lassú szaporodás a bélrendszerben - vaccina   Csirke salmonella – állatok oltása Konjugátum vakcina: B és helper T sejteknek ugyanazon molekuláris komplexben levő epitópokat kell felismerniük Haemophilus influenzae B: Tsejt-független B sejt válasz poliszaharid a baktérium kapszulára tetanusz toxoid + poliszaharid konjugátum - T sejtektől függő, hatékony válasz 2 év alatt is Tetanusz toxoid specifikus T sejtek citokineket termelnek – B sejt válasz: a bakteriális poliszaharid ellen

Haemophilus influenzae type B vaccine Konjugátum vakcina: B és helper T sejteknek ugyanazon molekuláris komplexben levő epitópokat kell felismerniük . Protein antigens attached to polysaccharide antigens allow T cells to help polysaccharide-specific B cells. Haemophilus influenzae type B vaccine is a conjugate of bacterial polysaccharide and the tetanus toxoid protein. The B cell recognizes and binds the polysaccharide, internalizes and degrades the whole conjugate and then displays toxoid-derived peptides on surface MHC class II molecules. Helper T cells generated in response to earlier vaccination against the toxoid recognize the complex on the B-cell surface and activate the B cell to produce anti-polysaccharide antibody. This antibody can then protect against infection with H. influenzae type B.

Reverz immunogenetika T sejt epitópok meghatározására Maláriára jellemző, a 9. helyen Pro tartalmú peptid - azonosítás T sejtek proliferációja Peptid -> terápia

Legyengített élő mikroorganizmus, mint vektor   más gének beépítése: kombinált vaccina: - baktérium, pl. Salmonella: +tetanusz toxoid ag, vagy: + Listeria monocytogenes Leishmania antigének Yersinia pestis Schistosoma mansoni - vírus vektor, pl. vaccinia +peptidek vagy fehérjék más mikroorganizmusokból   mint hordozó: antigén beépítve, több ag egyszerre adható nem ismételhető: vektor hosszan tartó védettséget vált ki heterológ vaccinák - rekombináns DNS technológia Szintetikus peptidek   T sejt epitóp azonositása,  peptid szintézis Hátrány: sokfélesség   ISCOM: immune stimulatory complex liposzómába zárt peptid – sejtbe bejut

Immunstimuláló komplex peptiddel Fúzió Peptid transzport az ER -be Peptid bemutatása az MHCI-en keresztül a T sejtek számára

Sikeres vakcinációs kampányok Diphtheria, polio, and measles and its consequences have been virtually eliminated in the United States, as shown in these three graphs. SSPE stands for subacute sclerosing panencephalitis, a brain disease that is a late consequence of measles infection in a few patients. When measles was prevented, SSPE disappeared 15–20 years later. However, as these diseases have not been eradicated worldwide, immunization must be maintained in a very high percentage of the population to prevent their reappearance. SSPE stands for subacute sclerosing panencephalitis

Diseases for which effective vaccines are still needed Diseases for which effective vaccines are still needed. *The number of people infected is estimated at ~200 million, of which 20 million have severe disease. †Current measles vaccines are effective but heat-sensitive, which makes their use difficult in tropical countries. Estimated mortality data for 1999 from World Health Report 2000 (World Health Organization).

A vírus fertőzések típusai polio, influenza, mumpsz, sárgaláz herpes, varicella, EBV HIV, hepatitis B, hepatitis C

Az immunválasz kialakulása a vírus fertőzést követően

Az ellenanyagválasz nem megfelelő specificitású, izotípusú illetve lokalizációjú Az ellenanyagválasz nem ad kielégítő védelmet A patogén adaptációs mechanizmusai gátolják a hatékony immunválasz kialakulását

Új Típusú Vakcinák: DNS targeting:   ·      megfelelő ligandum, ·      internalizáció és endoszóma ·      fúzió lizoszómákkal ·      lizoszomális enzimek degradálják Szintetikus virus

Ellenanyag termelés +citotoxikus T sejtek megjelenése –védelem a vírus ellen

Intranasalis, intrarectális, intravaginális immunizálás CTL indukálása Peyer plakkokban, lamina propriában történik Adjuvánsok : pl. kolera toxin B: cAMP indukció, IL-12 termelés különösen alkalmas nyálkahártya immunizálásra DNS alapú vakcináció: Bejuttatás: In vivo elektroporácó, génpisztoly – intramuszkulárisan Teljes Protein gén, vagy peptid epitóp MHCI, MHCII prezentáció Virális vektor (vaccinia, poxvirus) erősíti rec DNA vakcina hatását Nukleáris transzlokációs szignál DNS plazmid ligandum Endoszomális lizis, vagy bypass ? Szövetspecifikus regulálható promoter Terápiás gén

VAKCINÁK /kísérleti szakaszban a vakcina típusa vírus baktérium parazita élő, legyengített kórokozó   polio, kanyaró, mumpsz, rubeola, bárányhimlő, sárgaláz, rotavírusok, dengue láz, hepatitis A, tuberkulózis, tífusz, kolera, shigellózis, lepra elölt kórokozó polio, influenza, veszettség, hepatitis A/B szamárköhögés, tífusz, kolera, lepra, H. pylori, malária toxinok diftéria, tetanusz, kolera, lépfene, shigellózis, E. coli alegység vakcinák hepatis B, herpes simplex 2, influenza, papilloma, HIV, veszettség HiB, szamárköhögés, tífusz meningococcusok, pneumococcusok, H. pylori, malária, schistosomiasis, leishmaniasis vektor vakcinák HIV, kanyaró, veszettség kolera, shigellózis nukleinsav vakcinák HIV, influenza, herpes simplex 2, veszettség, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, papilloma, HTLV1, CMV tuberkulózis, tífusz

TERVEZÉS az epitóp kiválasztása az adjuváns kiválasztása irányítás, a bejuttatás helyének és módjának kiválasztása

A patogén felismerés és annak patogén virulenciát szolgáló módosulása PAMP: patogen associated molecular pattern PAMP Virulencia Faktorok Evolúció során konzervált termék Különböző patogéneknél más-más A mikroorganizmusok alapvető funkcióinak fenntartására fejlődött ki A gazdaszervezet adaptációja eredményeként fejlődött ki Nem specifikus a patogénre, patogének bizonyos csoportjára specifikus A patogénekre specifikus A természetes immunrendszert célozza PRR nem ismeri fel közvetlenül, néhány közülük befolyásolhatja a gazdaszervezet válaszát a PRR-en keresztül

Patogén mutációk szerepe a T-sejt felismerés gátlásában

A megfelelő epitópok kiválasztása

konformációs determináns N C hozzáférhető lineáris determináns limitált proteolízis C N nem hozzáférhető lineáris determináns N C denaturáció új determináns

Stratégia új generációs vakcinák fejlesztésére Vírusok – nem fejeznek ki megfelelő T sejt epitópot (szelekció az evolúció során) Tumor – hatékony T sejtek deléciója Immunogenitásának fokozása: „epitóp enhancement” peptid- MHC kötődés affinitásának növelése, MHCII –TH sejtek (pl. HIV), horgonyzó aminosavak javítása, kombinatórikus peptid könyvtár peptid-MHC komplex TCR-hez kötődés affinitásának növelése: kis és nagy affinitású T sejtek aktiválása, vagy repertoár torzulás pl.: tumor epitópot felimerő T sejtek számának növelése TCR keresztreaktivitás növelése: peptid kiméra – különböző vírus törzsek felismerése

A HLA-A2 és -B27 molekulák peptidkötése 1 1 6 7 8 7 8 9 3 3 5 4 5 2 4 6 2 9 L V R HLA-A2 HLA-B27 A 9 aminosavból álló peptidek megkötésére alkalmas peptid-kötő árokban csak a horgonyzó aminosavak illeszkednek a megfelelő peptid-kötő zsebekbe

új peptidek tervezése nagyobb affinitás keresztreagáló

A vakcina hatékonyságának fokozása a szekvencia módosításával

TERVEZÉS az adjuváns kiválasztása

az antigén immunogenitásának fokozása /a hordozó és az adjuváns partikularizáció (Al-hidroxid/foszfát, liposzómák, viroszómák) polimerizáció ( mannóz polimerek, MAP) emulzió (olaj / víz) mikrokapszuláció ( különböző sebességgel bomló polimerek) bakteriális eredetű termékek más kémiai adjuvánsok ( polinukleotidok, CpG ) citokinek ( IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, GM-CSF, TNF-, IFN-) antigén irányítás ( CR-ok, FcR-ok, MR, TLR-ok)

TERVEZÉS irányítás, a bejuttatás helyének és módjának kiválasztása

CR BCR FcR B / Mf / DC (alpopuláció) ?

A különböző vakcina típusok összehasonlítása   vakcina típus élő, legyengített elölt / alegység DNS / RNS az immunválasz típusa ellenanyag közvetített B- sejtek +++ sejtes CD4+ T-sejtek +/- TH1 +/-TH1* +++ TH1* CD8+ T-sejtek - ++ antigén bemutatás MHC I / II MHC II memória humorális +/- előállítása a kifejlesztés és termelés technikai kivitelezhetősége + ++++ ár szállítás és tárolás biztonságosság

ÉLETKOR TOXICITÁS naiv memória életkor naiv memória az adjuváns kedvezőtlen hatása (TH1/TH2) autoimmunitás előidézése (molekuláris mimikri) szennyeződések okozta (vírus, prion) beépülés a genomba / onkogének aktiválása

- biztonságos –alkalmazható gyermekeknek, felnőtteknek, mindenkinek A hatékony vakcina: - biztonságos –alkalmazható gyermekeknek, felnőtteknek, mindenkinek - hatékony a fertőzés ellen, vagy a betegség ellen (kevésbé jó) - megfelelő, tartós védettséget biztosít- memória (védettség élethosszig) - neutralizáló ellenanyagot indukál - T sejtes választ indukál - stabil, olcsó, kevés mellékhatás - könnyen alkalmazható (orális vakcina, egy alkalom az ideális-pl. Sabin csepp) - elfogadható és alkalmazható mindenhol (fejlődő világ).   Adjuváns alkalmazása: nem specifikus szignál- makrofágok stimulálása citokin indukció, antigén-depó: lassú felszívódás alumínium hidroxid alap, vagy olaj emulzió. Kevert oltásnál egyik adjuválhatja a másikat (pl. Bordatella Pertussis+ tetanus+diftéria) citokinek együttes alkalmazása: IL-12 - TH1 választ segiti Az immunizálás módja: Lényeges az antigén szervezetbe jutásának helye Orális vakcinák – mucosa szerepe (MALT)

CTL aviditás növelése: HLA- tetramer: peptid+HLA biotinilálva + avidin a tetramerekkel nagy aviditású CTL stimuláció (vírus), vagy: CTL szelekció –visszaadás – tumor sejtek hatékony pusztítása Cytokinek és kostimulátor molekulák: Adjuváns szerepe: megfelelő citokinek megfelelő mennyiségben való szintézisének stimulációja Vakcinával kombinált alkalmazás Citokin gén transfekció- erősíti a virális vektor hatását IL-12, IL-2, IL-15 Ko-stimulátorok: B7-1 (CD80), CD40L (CD154)

Dendritikus sejtek mint vakcina hordozók

A tumornövekedéssel párhuzamosan kifejlődő anti-tumor válasz modellje Tumor sejt megjelenik Immunrendszer észleli, DC feldolgozza, bemutatja a tumor antigéneket Aktivált T sejtek , ellenanyagok megkísérlik elpusztítani a tumort Tumor eltávolítása nem hatékony: sok sejt, sok mutáció-megváltozott ag, tumor gazdasejt elleni pusztító hatása. Elvándorlás, áttét Figure 1 | A probable model of the evolution and fate of antitumour immune responses that develop coincidently with tumour growth.   a | Tumours develop over a long period of time through a process of accumulation of many mutations. While the tumour is small and does not present a significant danger to the integrity of the organ of origin, the immune system remains ignorant of its presence. Dendritic cells (DCs) in the surrounding tissue are not activated and as a result T and B cells in the lymph node remain in a resting state. b | When the tumour becomes larger, heterogeneous and ultimately malignant, damage to the normal tissue and products made by the tumour cells alert the immune system mainly through the activation of resident DCs. Activated DCs that have taken up products derived from damaged normal tissues and tumours, traffic to the draining lymph node in which they begin to present these products as antigens to naive T and B cells. The extent of DC activation determines the extent of lymphocyte stimulation. This in turn is regulated by many factors that determine the immune competence of the patient, including age. c | Tumour-specific T cells, antibodies and activated DCs reach the tumour site and attempt to destroy the tumour. They are only partially successful owing to an already large tumour size and marked tumour heterogeneity that allows the tumour to evade many immune effector mechanisms. d | The tumour that has evaded the initial immune response continues to grow, disseminate and actively suppress local, as well as systemic, immunity illustrated by the presence at the tumour site of DCs, T and B cells that are not activated and do not exert their respective functions.

Az anti-tumor válasz manipulálása – terápiás vakcináció Figure 2 | Manipulation of antitumour immune responses by therapeutic vaccination.   a | Therapeutic vaccines are administered after the tumour is diagnosed, at the time of interactions between the tumour and the immune system that correspond to parts c and d in Fig. 1. In the most optimal clinical setting, therapeutic vaccines intend to boost immunity against minimal residual disease and prevent the outgrowth of metastases shown in parts b and c. A vaccine based on autologous tumour or defined tumour antigens is administered in an immunostimulatory preparation (with adjuvant) that can activate Langerhans cells — dendritic cells (DCs) that reside in the epidermis. Activated Langerhans cells take up the tumour antigens and traffic to the draining lymph node in which they present antigens to T cells. B cells are also activated and the expected outcome is clonal expansion of tumour-specific T cells and the production of tumour-specific antibodies. b | Tumour-specific T cells migrate to the sites of tumour metastases where they attempt to kill tumour cells that express antigens contained in the vaccine. Their function is compromised by the immunosuppressive tumour microenvironement, which affects their function and leads to their death. Furthermore, tumour heterogeneity has been established over time. Some tumour cells have lost expression of antigens that are targeted by the immune response and others have become resistant to immune effector mechanisms. This allows many of the cells to evade the immune attack. c | Metastases that continue to grow are composed of tumour cells that lack antigens recognized by T cells and antibodies or are otherwise resistant to immune destruction. Immunszuppresszív környezet, tumor megváltozása!

Az anti-tumor válasz kiváltása – megelőző vakcináció Figure 3 | Manipulation of antitumour immune responses by prophylactic vaccination.   a | Prophylactic vaccines would be administered before the occurrence of tumours to individuals who are at high risk for developing tumours or have been diagnosed with premalignant changes in target tissues. A vaccine based on antigen/s that are expected to be expressed by the anticipated tumour is administered in an immunostimulatory preparation (with adjuvant) that can activate Langerhans cells — dendritic cells (DCs) that reside in the epidermis. Activated Langerhans cells take up the tumour antigens and traffic to the draining lymph node in which they present antigens to T cells. B cells are also activated and the expected outcome is clonal expansion of tumour-specific T cells and the production of tumour-specific antibodies. This clonal expansion of effector cells is followed in time by the generation of a pool of memory cells that are specific for the tumour antigen/s. b | If a tumour begins to grow sometime in the future, tumour antigens that reach the draining lymph node will reactivate tumour-specific memory cells and elicit a swift secondary immune response. This response will be characterized by large numbers of effector T cells, high titre of antibodies and continuous activation of DCs at the tumour site, for continuous processing and presentation of tumour antigens and further amplification of the immune response. c | The incipient tumour has not been allowed to grow large and heterogeneous and is easily eliminated by the prepared immune response. Moreover, the memory compartment is further expanded by this tumour-mediated boost. Tumor-specifikus memóriasejtek aktiválásahatékony másodlagos válasz