ANTIGÉN, ELLENANYAG immunogenitás, tolerogenitás antigén fogalma epitop (B-, T-sejt epitop) haptén hordozó antigén prezentáció T independens antigének szuperantigének immunoglobulinok ellenanyag szerkezete izotípusok ellenanyagok funkciói poliklonális és monoklonális ellenanyagok passzív immunizálás humanizált ellenanyagok ellenanyagok felhasználása gyakorlat: monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása sejtszámolás gyorsklónozás ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfociták, antigén receptorok, ellenanyagok kapcsán beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

Definíciók Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál. Antigenitás: immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” Ilyenek pl. a saját fehérjék

Az immunogenitást befolyásoló tényezők I. Idegen-saját (immunogén-tolerogén) Méret/komplexitás (nagyobb antigénen több „dolgot” lehet felismerni) Genetikai háttér faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) Fizikai állapot (pl. immunodefficiencia, éhezés)

Az immunogenitást befolyásoló tényezők II. Dózis Bevitel módja és útja Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: - depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte - a természetes immunitás aktiválása - járulékos sejtek aktivációja

Az immunogenitást befolyásoló tényezők III. Az antigén fizikai sajátságai - részecske (sejt, kolloid) vagy oldott („hordozó”/méret) - denaturált vagy natív (epitopok) Lebonthatóság - antigén prezentáció APC által Hozzáférhetőség (szemlencse fehérjék elzártak az immunrendszertől)

(animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek Antigén

Antigén determináns (epitop) Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel.

B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék szénhidrátok lipidek DNS szteroidok stb. - mesterséges vegyület is lehet! szöveti vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigént.

A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T-sejt receptor felismerni képes Hordozó az immunglobulinnal vagy T-sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők! A hordozó fogalmát főleg vakcinákkal kapcsolatban használják

Antigén Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. (animált ábra)

Az antigén bemutatás vázlatos folyamata (animált ábra) Az antigén bemutatás vázlatos folyamata CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Exogén fehérjék MHC I MHC II APC Endogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén.

AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig) (BCR, Ig) konformációs determinánsok Ab2 Ab1 sejtfelszíni/hozzáférhető determináns hasítás A lineáris determináns elég megtévesztő – itt is a konformáció a lényeg! Az APC-s ábra után vissza kellene térni ehhez az ábrához a neoantigének és a lineáris determinánsok miatt denaturáció rejtett/feltárt determináns új/neoantigén determináns konformációs/lineáris determinánsok WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP? ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 TLR4 Az LPS molekula egy glökózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag LPS LPS MD2 MD2 Fc LPS Fab Fab MD2 TLR4 LPS LPS TLR4 MD2

A B sejtek antigén általi aktivációja gyakran csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges Mindkét sejt aktivációjával jár antigén CD40L A B sejtek által felismert antigének java része nem képes a B sejtek kellő aktiválására. Th sejtek segítsége szükséges az aktivációjukhoz, nélkülük nincs pl. izotípusváltás, memória sem. Az egyszerű bakteriális poliszaharid vakcinák nem képesek hosszútávú immunitást kialakítani. CD40 citokinek B sejt aktiváció, memória Vannak olyan antigének (pl. poliszaharidok) amik nem prezentálódnak

A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének” T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 B SEJT Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ (extra aktivációs szignál) (extenzív receptor aggregáció)

Gyakorlati példa (pl. Prevenar - pneumokokkusz vakcina) Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a vakcinában felhasználandó tisztított bakteriális poliszaharidok nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre memória B sejt válasz Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat immunogén fehérjéhez konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes blokkoló antitestek indukciójára. toxin Glu  Gly toxoid pneumokokkuszból származó poliszaharidok

toxoidból származó peptid A poliszaharid epitopot felismerő B sejt képes a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek toxoidból származó peptid toxoid poliszaharid MHCII TCR BCR segítő T sejt B sejt citokinek, CD40-CD40L poliszaharidot felismerő memória B sejtek ( ellenanyag termelő effektor sejtek)

HAPTÉNEK Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek immunválaszt indukálni (pl. gyógyszerek, reaktív vegyületek) - haptén (i.e. DNP: dinitrofenil) 1. + a + jel itt a reaktív ellenanyagok jelenlétét jelenti , nem azt, hogy az egér „új immunválaszt csinál” hordozó + haptén 2. + haptén immunizált

A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI hordozó+haptén ellenanyag/antitest hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus

SZUPERANTIGÉNEK Olyan mikrobiális fehérjék, melyek APC jelenlétében több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat, s ezáltal poliklonális aktiválást eredményeznek

SZUPERANTIGÉNEK Osztályozás Forrás Endogén Exogén B sejt   Exogén B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) Epstein-Barr virus (EBV) Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ Streptococcal superantigen :SSA Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) Cholera toxin:  subunit A of cholera toxin Prevotella intermedia* Mycobacterium tuberculosis* Viral superantigens:  (a) Mouse leukemia virus                                         (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3                                         (c) HIV-Nef                                         (d) Rabies virus-nucleoside protein Staphylococcal protein A Protein G Protein Fv (PFv)   .

Szuperantigének Konvencionális Antigén Szuperantigén Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat. Konvencionális Antigén Szuperantigén Részletek az előadáson Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz 1:104 - 1:105 (107 / 1011 Poliklonális T sejt válasz 1:4 - 1:10 1010 / 1011) aktivált T sejt

Az immunglobulinok szerkezete és funkciója

Immunoglobulinok (glikoproteinek) Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek

Az immunoglobulin szerkezete Könnyű és nehéz láncok (ember, egér) Diszulfid hidak láncok közötti láncon belüli diszulfid híd komplement aktiváció szénhidrát Variabilis és konstans régiók Kapocs régió CH1 VL CL VH CH2 CH3 Domének VL & CL VH & CH1 - CH3 (CH4 pl. IgM) Oligoszaharid kapocs régió Fc receptorhoz kötés

HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK könnyű lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc nehéz lánc nehéz lánc hipervariábilis régiója

Ribbon structure of IgG

placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában antigén- kötés komplement kötő hely placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz

Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések Papain Fab Ag kötés (valencia=1 monovalens) Specificitást a VH és a VL domének határozzák meg VH VL Fc Effektor funkciók Fc Fab

Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések Pepszin F(ab’)2 Antigén kötés bivalens! valencia=2 bivalens – képes lehet precipitációra, agglutinációra Fc peptidek + F(ab’)2 Az effektor funkciók egy részét nem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra

Miért szükséges az Fc régió? felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’)2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – Gm allélek A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) (Ez felel a sokféle antigén specifikus megkötéséért!) Gm allotípusok kapcsolatban lehetnek egyes betegségekkel – pl. szklerózis multiplexszel Clin Immunol Immunopathol. 1985 Nov;37(2):143-53. IgG (Gm) allotypes and multiple sclerosis in a French population: phenotype distribution and quantitative abnormalities in CSF with respect to sex, disease severity, and presence of intrathecal antibodies. Sesboüé R, Daveau M, Degos JD, Martin-Mondiere C, Goust JM, Schuller E, Rivat-Peran L, Coquerel A, Dujardin M, Salier JP. --------------------------------------------- Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 22;105(29):10131-6. Epub 2008 Jul 21. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study. McCormick AA, Reddy S, Reinl SJ, Cameron TI, Czerwinkski DK, Vojdani F, Hanley KM, Garger SJ, White EL, Novak J, Barrett J, Holtz RB, Tusé D, Levy R. Plant-made vaccines have been the subject of intense interest because they can be produced economically in large scale without the use of animal-derived components. Plant-made therapeutic vaccines against challenging chronic diseases, such as cancer, have received little research attention, and no previous human clinical trials have been conducted in this vaccine category. We document the feasibility of using a plant viral expression system to produce personalized (patient-specific) recombinant idiotype vaccines against follicular B cell lymphoma and the results of administering these vaccines to lymphoma patients in a phase I safety and immunogenicity clinical trial. The system allowed rapid production and recovery of idiotypic single-chain antibodies (scFv) derived from each patient's tumor and immunization of patients with their own individual therapeutic antigen. Both low and high doses of vaccines, administered alone or co-administered with the adjuvant GM-CSF, were well tolerated with no serious adverse events. A majority (>70%) of the patients developed cellular or humoral immune responses, and 47% of the patients developed antigen-specific responses. Because 15 of 16 vaccines were glycosylated in plants, this study also shows that variation in patterns of antigen glycosylation do not impair the immunogenicity or affect the safety of the vaccines. Collectively, these findings support the conclusion that plant-produced idiotype vaccines are feasible to produce, safe to administer, and a viable option for idiotype-specific immune therapy in follicular lymphoma patients. Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok Egyeden belüli típusok Egyedek közötti változatok

Humán Immunglobulin Osztályok IgG - gamma () nehézláncok IgM - mü () nehézláncok IgA - alfa () nehézláncok IgD - delta () nehézláncok IgE - epszilon () nehézláncok Izotípusok! könnyűlánc típusok kappa () lambda ()

Szabad IgM pentamer (”csillag”) Antigénhez kötött IgM (”rák”)

ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK JELLEMZÉSE 2.

Izotípusok a primer és szekunder immunválasz során ellenanyagszint szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben primer válasz a B antigénnel szemben napok

Az ellenanyag termelés az első és a második immunválasz során növekvő szérum ellenanyag titer hetek X-antigén első X-ellenes válasz második X-ellenes alacsony magas antigénfüggő 100-1000x erősebb az első válasznál A B-sejt antigénnel való találkozásáig eltelt idő Az antigénnel való találkozás és a válasz csúcspontja között eltelt idő Az ellenanyagtermelés mértéke A termelt izotípusok Ellenanyag affinitás B-sejt típus Tulajdonság első válasz második válasz

Izotípusváltás a B-sejt fejlődése során Isotype Switching during B Cell Development During the initial stages of a B cell’s primary response to antigen, it produces and secretes IgM. Later in the primary response or during subsequent responses, different heavy chain isotypes may be expressed by the progeny of the original IgM-producing clone. Such “switching” occurs at the DNA level, resulting in the production of an Ig protein with the same V region but a different C region. Thus, over the lifetime of a B cell clone, it may produce antibodies of the same specificity but different isotypes.

ANTIGÉNKÖTÉS

Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás elve

Az „Fab-lizozim” komplex röntgenkrisztallográfiás képe X-Ray Crystallography of Fab Lysozyme Complex. Top panel: Anti-lysozyme Fab (light chain in yellow, heavy chain in blue) binds to lysozyme (green). A critical residue of lysozyme, Gln 121, is shown in red. Center panel: Computer-generated image of separated components. Bottom panel: Rotation of separated components to show the contact residues in red (16 in each case) involved in Fab/lysozyme binding. Gln 121 (white) projects slightly from the lysozyme contact area, but is accommodated by a small cleft formed by the CDRs on the Fab binding surface. Reproduced with permission from Amit A. G. et al. (1986) Three-dimensional structure of an antigen–antibody complex at 2.8 angstroms resolution. Science 233, 747–753. A különválasztott komponensek felszíni képe. Piros szín jelzi az Fab-lizozim komplex kölcsönhatásban résztvevő oldalláncait.

HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK könnyű lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc nehéz lánc nehéz lánc hipervariábilis régiója

(a különböző aminosavak száma) Complementary Determining Region (CDR) (a különböző aminosavak száma) Variábilitás aminosav pozíció az Ig-lánc szekvenciájában

Az ellenanyag-antitest kötődés jellemzése Valencia: az antitestnek az antigénnel kialakított kapcsolatainak száma Affinitás: egy adott antigén és antigénkötő hely kapcsolatának erőssége Aviditás: az adott antitest összes kötőhelye affinitásainak „eredője” (nem az összege) sztérikus hatás

NEUTRALIZÁCIÓ Az antigén kötés önmagában védő funkciót láthat el: sejtkárosodás vírusok, baktériumok, toxinok (bakteriális, rovar v. kígyóméreg) sejtvédelem

KÖTŐDÉS AZ Fc-RECEPTOROKHOZ

(A) A nagy affinitású Fc-receptor a sejt felszínén monomer Ig-t köt, mielőtt az az antigénhez kapcsolódna. (pl. FceR – IgE) (B) A kis affinitású Fc-receptor a már multivalens antigénhez kapcsolódó Ig-kat köti meg. (pl. FcγR – IgG) FcR – IgE Effektor sejt aktiválás komplex antigén FcgR – IgG+Ag Effektor sejt aktiválás ellenanyag kötődve a komplex antigénhez ellenanyag

OPSZONIZÁLÁS FAGOCITÓZIS OPSZONIN NÉLKÜL OPSZONINNAL IDŐ IDŐ

- Komplement aktiváció (következő alkalommal) - Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal (NK SEJT DEGRANULÁCIÓ) Citotixikus granulumok tartalmának ürítése membránkárosodás és nekrózis a patogén puszulásához vezet nagyméretű patogén ellenanyaggal borítva - Komplement aktiváció (következő alkalommal)

„felfegyverzett” hízósejt a kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ ellenanyaggal „felfegyverzett” hízósejt IgE-k keresztkötése a kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül degranuláció patogén eliminálása (allergiás tünetek)

!!! összefoglalva AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI OPSZONIZÁCIÓ - FcR mediált funkciók - komplement aktiválás NEUTRALIZÁCIÓ !!!

MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS Poliklonális ellenanyag Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

Monoklonális ellenanyagok előállítása Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre (lásd a táblázatot hátrébb) Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént (az anigén valamelyik részéhez kötődő ellenanyagot termel), sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben)

Monoklonális ellenanyagok (animált ábra) Antigén Monoklonális ellenanyagok Poliklonális ellenanyagok

Monoklonális ellenanyagok egyetlen B-limfocita klón termékei homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban)

Myeloma multiplex A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma

Lehetőségek? Transzformáció vírussal -A vírus ott lesz a termékben is Fúzió immortális sejtvonallal -Kevés jó fúziós partner létezik

Monoklonális ellenanyagok előállítása A hibridóma technika lényege (Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) A hibridóma technika lényege számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük. lényege, hogy antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag- vagy citokin-termelő* képesség) és korlátlanul szaporodnak. ( *pl. antigén specifikus, citokin termelő, T sejt hibridómák is létrehozhatóak) A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg.

Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan egér/patkány beoltása antigénnel a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető

Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak (animált ábra) Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek

Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny 1. szelekciós lépés Szaporodó sejtek lépsejt mielómasejt (SP2) HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny a normál sejtek napokon belül elpusztulnak HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- (animált ábra)

Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek 2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása (animált ábra) Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk.

(ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon) (animált ábra) A sejtklónozás célja A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termel, melyek között kevés az antigén specifikus Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon)

A „HAT” szelekció biokémiája A szelektív tápfolyadék: A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer

”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok (animált ábra) A DNS szintézis két fő útja ”salvage” útvonal nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek aminopterin HAT médium – Hipoxantin+Aminopterin+Timidin Az aminopterin az anyagcsere blokkoló. A hipoxantin és a timidin a salvage útvonal alapanyagai. Az SP2 mielóma sejtekben csak ez az útvonal működőképes! ”de novo” útvonal

Technikai nehézségek: A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT-, TK- (defficiens) fúziós partner sejtvonal? ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT- és TK- fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT+ vagy TK+ sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT- TK- sejteket.

A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma több egy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus Affinitás kicsi-nagy (keverék) kicsi nagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magas alacsony (0) Hozam (koncentráció) alacsony Előállítási költség Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű Mennyiség limitált korlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló

Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei a klinikai gyakorlatban DIAGNOSZTIKA Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása (szérumból, liquorból, …) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása Immunhisztokémia Limfómák tipizálása CD markerek segítségével TERÁPIA Sejtek elválasztása CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata Sejt aktiváltsági állapotának vizsgálata Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin limfómában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással

Passzív immunizálás I. VESZÉLYEZTETETT EGYED egér monoklonális ellenanyagok Humán immunglobulin transzgenikus egér humanizált, egér monoklonális ellenanyagok immunizálás humán monoklonális ellenanyagok VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag (pl. véradás  vérkészítmény) VESZÉLYEZTETETT EGYED Az adaptív immunrendszer nem aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás (Immunoglobulin lebomlás!)

Passzív immunizálás II. Típus Alkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG) Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek? Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva -fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

A monoklonális antitestek evolúciója Humán Egér / Patkány Kiméra Humanizált The participation in regulatory review allows the researcher reviewer a reality check for the real regulatory impact of the MOA data A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok - Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége

Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában „Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2. konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

Immunszuppresszív ellenanyagok 1. Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

Terápiás monoklonális antitestek elnevezése A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

old new meaning meaning Prefix Target substem Source substem variable -anibi- — angiogenesis (inhibitor) -a- rat -ba(c)- -b(a)- bacterium -e- hamster -ci(r)- -c(i)- circulatory system -i- primate -fu(ng)- -f(u)- fungus -o- mouse -ki(n)- -k(i)- interleukin -u- human -le(s)- — inflammatory lesions -xi- chimeric (human/foreign) -li(m)- -l(i)- immune system -zu- humanized -mu(l)- — musculoskeletal system -xizu-* chimeric/humanized hybrid -ne(u)(r)- -n(e)-* nervous system -axo- rat/mouse hybrid (see trifunctional antibody) -o(s)- -s(o)- bone -toxa- -tox(a)- toxin -co(l)- -t(u)- colonic tumor Az immunszupresszív hatás esetleg opportunista fertőzéseket eredményezhet: wikipedia: The boxed warning for the drug rituximab (Rituxan, co-marketed by Genentech BioOncology and Biogen Idec) includes that JC virus infection resulting in progressive multifocal leukoencephalopathy and death has been reported in patients treated with the drug The boxed warning for the drug natalizumab (Tysabri, marketed by Elan and developed by Biogen Idec) includes that JC virus resulted in progressive multifocal leukoencephalopathy developing in three patients who received natalizumab in clinical trials. The boxed warning was added Feb. 19, 2009 for the drug efalizumab (Raptiva, marketed in the U.S. by Genentech, and marketed in Europe by Swiss drugmaker Merck Serono) includes that JC virus resulting in progressive multifocal leukoencephalopathy developed in three patients who received efalizumab in clinical trials. The drug was pulled off the U.S. market because of the association with PML on April 10, 2009. The JC virus or John Cunningham virus (JCV) is a type of human polyomavirus (formerly known as papovavirus) and is genetically similar to BK virus and SV40. It was discovered in 1971 and named after the two initials of a patient with progressive multifocal leukoencephalopathy (PML).[1] The virus causes progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) and other diseases only in cases of immunodeficiency, as in AIDS or during treatment with drugs intended to induce a state of immunosuppression (e.g. organ transplant patients). -go(t)- testicular tumor -go(v)- ovarian tumor 'Suffix' (stem) -mab -ma(r)- mammary tumor -me(l)- melanoma -pr(o)- prostate tumor -tu(m)- miscellaneous tumor -vi(r)- -v(i)- virus

Immunszuppresszív ellenanyagok 2. Muromonab-CD3 (OKT-3) egér IgG2a CD3 pan-T sejt antigén ellen, szervátültetést megelőzően vagy követően alkalmazott immunszupresszív kezelésre; ma már ritkán használják (fajidegen fehérje!); humanizált változatával I-es típusú diabetes mellitusban folynak vizsgálatok Omalizumab (Xolair): IgE elleni humanizált IgG1k monoklonális antitest Ind.: allergiás asthma, Churg-Strauss szindróma Daclizumab (Zenapax): IL-2 receptor elleni, humanizált antitest. Ind.: transzplantációt követően kilökődési reakció ellen, T-limfocita aktivitás gátlására basiliximab (Simulect): mint daclizumab, de kiméra! efalizumab (Raptiva): anti-CD11a, humanizált, ind.: psoriasis

Regisztrált molekulárisan irányított szerek Név Típus Támadás-pont Indikáció Alemtuzumab (Mabcampath) Daclizumab (Zenapax) Basiliximab (Simulect) Rituximab (Rituxan/Mabthera) Trastuzumab (Herceptin) Gemtuzumab Ibritumomab (Y90) Edrecolomab Gefitinib Imatinib Monoklonális Ab, humanizált Monoklonális IgG1, kiméra Monoklonális IgG1, humanized Monoklonális IgG4, humanized Calicheamicinnel konjugált Monoklonális IgG1, egér Monoklonális IgG2, egér EGFR-TKI KIT-TKI CD52 IL-2 R CD20 HER2/neu CD33 EpCAM EGFR TK TK CLL, CML rák, leukémia rák, limfóma emlő-, prosztatarák, NSCLC CRC NSCLC GIST, CML

További lehetőségek monoklonális ellenanyagok terápiás felhasználására Radio-immunotherápia Pl. Zevalin, Bexxar – monoklonális + izotóp Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később szisztémásan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá Immuno-liposzómák Liposzómába csomagolt nukleotidok vagy gyógyszer célzása monoklonális antitestekkel (pl. tumorszuppresszor gének bevitele, szövetspecifikus génbevitel) Nem immunológiai célpontú manipulációk pl. abciximab (ReoPro): thrombocyta-aggregatio gátlása

Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia) oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék rákötött antigének affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag (animált ábra) tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok (animált ábra) Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop polimer gyöngy Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

gyakorlati rész

A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció (animált ábra) Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció

Nem kötődő fehérjék lemosása (animált ábra) Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. Coomassie Brillant Blue G250 festék

Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról (animált ábra) Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon

Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): a hibridóma sejteket megszámoljuk 96 lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100 l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) 1000-5000 sejtet 100 l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100 l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200 l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B D E F G H C Felező hígítások

Bürker kamra × 104 =sejtszám/ml 25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm3 = 10-4 cm3 (ml) a megszámolt sejtek száma × 104 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml