Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása áramlási citometria A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás (már amennyiben az a tulajdonság megragadható – pl. intracelluláris antigének közti különbségekkel nem nagyon lehet mit kezdeni) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének Kétféle alap hozzáállás: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága

Ficoll-Paque sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) vérlemezkék granulociták

Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

Ellenanyag ”panning” kitapasztott ellenanyagok

Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak)

Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől Mágneses sejtszeparálás (MACS) specifikus ellenanyag paramágnesesség – nem mágneses anyag, ami mágneses térben maga is mágnesessé válik (pl. vas) paramágneses szemcse

MACS

A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sejtfunkciókat általában nem befolyásolják                                                                           CD8+ T cells

Mágneses sejtszeparálás (MACS) oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szelekció) CliniMACS – zárt rendszerű

Áramlási/áramlásos citometria A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az immunofluoreszcenciai módszerek eszköztárába tartozik, felhasználásuk kiegészíti egymást folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket vizsgál a fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja morfológiai adatokat csak közvetetten szolgáltat (méret, granuláltsági állapot) Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas FELHASZNÁLÁS: Sok sejtes populáció alkotóinak százalékos aránya (statisztikai adatok) Kis százalékban jelenlevő sejtek vizsgálata

Áramlási citometria Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található, ezért pl. sejtszuszpenzióban fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és sejtenként vizsgálható A sejtek nagy sebességgel egyenként áramlanak át a fényforrás fényén. A nagy sebességgel áramló nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle.

Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése fotoelektron-sokszorozó csövek sávszűrők PMT 4 dikroikus tükrök minta PMT 3 áramlási cella PMT 2 Dikroikus tükrök: csak egy adott hullámhosszóság alatti vagy feletti fényt áteresztő a többit tükröző tükör. Ferdén elhelyezve a megfelelő színű fény leválasztható a többiről. Sávszűrők: adott hullámhossz tarrományú fényt áteresztő, a többit elnyelő „klasszikus” fényszűrők. PMT – fotoelektron sokszorozó (photomultiplayer tube) PMT 1 FSC detektor fotodióda Laser

A citométer hidrodinamikai rendszere vivő- vagy köpeny folyadék Áramlási cella Injektor Fluoreszcens szignálok Fókuszált lézer sugár vivő folyadék + + + minta akár 6-10m/s sebesség Így valósul meg a gyakorlatban. A sejteket tartalmazó folyadékot („minta”) enyhe többletnyomás nyomja a köppenyfolyadék áramlásába.

Fluoreszcencia detektorok Lézer FALS Sensor FSC Fluoreszcencia detektorok (PMT3, PMT4, stb.) autofluoreszcencia - piridinek és flavinok jelenléte miatt

Becton Dickinson citométerek a ’80 –as ’90 – es évekből Az alsó a mienk

szorter-áramlási citométer asztali áramlási citométer Ezt benne lehetne hagyni, hiszen ilyesmikkel találkozhatnak majd Itt is az alsó a mienk (is) szorter-áramlási citométer (FACS)

Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének alapján Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van. Diagnosztikus értékű lehet: a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése Példák: gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának növekedése HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T sejtek számának csökkenése CD4+ : CD8+ = 1.6 Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T sejt szám <200/l - CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része

WAS: Wiscott-Aldrich Syndrome (WAS protein defektus) XLA: X-linked Agammaglobulinemia (Btk defektus) egyik tüneti jellemzője sok közül: CD43 expresszió csökkent v. hiányzik WAS - Wiscott-Aldrich Syndrome protein (WASP) defektusa (hiány vagy működészavar). A CD43 hiány csak egy a sok diagnosztikus marker közül és önmagában valószínűleg kevés a WAS diagnózisához This protein is expressed by hematopoietic cells and appears to play a role in actin polymerization and cytoskeleton arrangement. The mutations are associated with either lack of synthesis or with synthesis of an abnormal WASP. In the absence of functional WASP, hematopoietic cells demonstrate abnormal size, shape, and function that is most apparent in platelets and lymphocytes. XLA – Btk tirozin kináz defektusa miatt jön létre, pre-B sejt szinten megrekednek a sejtek B-sejtek fejlődésének megrekedése egyik jellemző tünet: CD19+ sejtek hiánya

CD antigén sejttípus funkció ligand T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 A megbeszéltek vannak megemlítve és egy két olyan ami említésre kerül ebben az anyagban. LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de az opszonizáláshoz jobb mint az eredeti)

oldal irányú fényszórás (SSC) előre irányuló fényszórás (FSC) A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van granulociták oldal irányú fényszórás (SSC) (pl.granuláltság) monociták Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek fényszórása (a vizsgálatot zavaró eritrociták elötte lizálva lettek) Látható, hogy a granulált sejteknek milyen nagy az oldalszórásuk (SSC). A granulált sejtek előre irányuló szórása(FSC) is nagyobb a granulálatlanoknál, de kevésbbé nyilvánul meg az oldalszóráshoz képest. Az FSC nagysága ezért csak hasonló granuláltságú sejteknél jellemző a méretre. limfociták előre irányuló fényszórás (FSC) („méret”)

A vérminta vörösvérsejt mentesítéséhez használt módszer befolyásolja a megmaradó sejtek százalékos összetételét az eritrociták lizálásával kapott eredmény sűrűség alapú elválasztással kapott eredmény (Ficoll) hiányzó granulociták

A ”kapuzás” segítségével az egyes populációk külön-külön jellemezhetők (gating) limfociták granulociták összes sejt monociták granulocita „kapu” monocita „kapu” A granulociták CD4 „expressziója” autofluoreszcencia vagy az FcR-ok általi aspecifikus kötődés következménye – csak kontroll ellenanyaggal összehasonlítva szabad kimondani valamiről, hogy pozitív limfocita „kapu”

NK B A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) A jelölés az elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) Azért az NK sejteken is lehet (valamennyi) CD8 Th NK Tc B A perifériás vérben jelenlévő limfociták

nagy sebességű folyadékáram A CD4-FITC jelölt (TH) sejt (küvettában, vagy szabadon) A CD4-FITC jelölt (TH) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás Fókuszált lézernyaláb A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont CD4 FITC

A CD8-PE jelölt (Tc) sejt detektálása jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás CD4 FITC

A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B sejtek) jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás CD4 FITC

kvadráns statisztika 18% 0% CD8 PE 44% CD4 FITC 38% A statisztikai adatok mérés közben is megtekinhetők 44% CD4 FITC 38%

Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot A „plot”-ok a különféle sejtek százalékos megoszlása bemutatásának eszközei. A klasszikus dot-plotban egy-egy pont egy-egy sejtet reprezentál. Normál vérben is előfordulnak kis mennyiségben CD4+/CD8+ duplapozitív sejtek! Az enyhén CD8+ sejtek valószínűleg NK sejtek.

Ábrázolásmódok 2. Hisztogramm A hisztogramm felfogható egy oldalról megtekintett kontúrplotként is. Ugyan sok esetben a hisztogrammokkal is lehet százalékos megoszlást bemutatni, de inkább a „festődés” mértékének (a kimutatandó sejtfelszíni molekulák mennyiségének) összehasonlítására való egyes minták közt.

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) kapuzással elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján PMT 4 Minta PMT 3 Áramlási cella PMT 2 PMT 1 Laser

B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták

Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik A rezgés piezoelektromosságon alapul. Ultrahang frekvenciájú (15-100 kHz). Azonos frekvenciával megvilágítva (stroboszkóp) a rezgésenként képződő cseppek állni látszanak. A cseppképződési pontot befolyásolja a rezgés frekvenciája, amplitúdója, a folyadékáram sebessége, stb. breakoff point

- - - - - - - - - + + + + Lézer vibráció + Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra arra az időre elektromos töltés kapcsolódik, így a leváló csepp töltötté válik. - + - + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + + - + + + - A lézeres detektáláshoz képest a töltés bekapcsolását ennek megfelelően időben annyival később végzi a berendezés, amennyivel később a folyadékáramban levő sejt eléri a csepp-képződés helyét (”drop-delay”). Ez a késleltetési idő, ismerve frekvenciát, a megvilágítás és a csepp-képződési pont közötti távolságot, és a cseppek távolságát (azaz a ”cseppképződés hullámhosszt”) kiszámolható, és a berendezésen beállítható. - - - - - Gyűjtőcső Gyűjtőcső