IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (ÁOK 2012) Rövid tartalom: Immunszerológiai módszerek Immunkomplexek túltermelődésével járó kórképek

Agglutináció és precipitáció precipitáció, immunkomplex képződés agglutináció

Antigén- antitest kapcsolat (nem kovalens)

Immunkomplex és precipitátum antitest antigén Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

Gyűrű precipitáció Ring precipitin test: http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap18/lecture2.htm

Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: -valencia (kapcsolatteremtő képesség) hőmérséklet (37оC ; 4 оC ) pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG) IgM-pentamer IgA-dimer PEG= polietilén-glikol Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

MÓDSZEREK Immundiffúzió: (agargélben, antigén, antitest precipitációs reakcióján alapul) - radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra elektroforetizálják) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

Immundiffúziós módszerek poliklonális ellenanyag agaróz gélbe keverve Meghatározandó antigén az agarózba vájt lyukakban pl. immunglobulin meghatározásra használható az antigén és az ellenanyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi

Mancini-módszer 10

Antigén koncentráció meghatározása Mancini módszerrel Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml Átmérő négyzete IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció The diameter of the ring is proportional to the log of the concentration of antigen since the amount of antibody is constant. Thus, by running different concentrations of a standard antigen one can generate a standard cure from which one can quantitate the amount of an antigen in an unknown sample. Thus, this is a quantitative test. If more than one ring appears in the test, more than one antigen/antibody reaction has occurred. This could be due to a mixture of antigens or antibodies. This test is commonly used in the clinical laboratory for the determination of immunoglobulin levels in patient samples.

Radiális kettős immundiffúzió Immundiffúziós módszerek Az antigént tartalmazó lyuktól egyenlő távolságra elhelyezett ellenanyagok különböző koncentrációban. Az antigén és az ellenananyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi, ebből az ellenanyag koncentrációra következtethetünk. Fordítva, az antigén koncentráció meghatározására is alkalmas a módszer. Videó: http://youtu.be/uNG-jZxvhcg jobb oldali 3 ábra: fent: 1 és 1 antigén azonos középen: 1,2,3 különböző antigének alul: 1 és 2 részben azonos, de a 2-n van legalább egy olyan epitop ami az 1-en nincs (ezért a „sarkantyú”) Radiális kettős immundiffúzió Antigének közös determinánsainak vizsgálata 12

Szérum elektroforézis

Mi a különbség a plazma és a szérum között?

Szérum elektroforézis

Gamma-globulinok relatív túlsúlya http://www.pathguy.com/lectures/proteins.htm Poliklonális gammopátiák esetében a gamma-globulinok relatív arány megnövekszik, kiemelkedő hegyes csúcs (M-spike) nélkül. Krónikus májbetegségben nem gamma-globulinok mennyisége több, hanem az egyéb plazma fehérjék termelődnek kisebb mennyiségben. A gamma-globulink ténylegesen emelkedettek lehetnek krónikus gyulladás (SBE: subacute bacterial endocarditis, fertőzés (pl. AIDS) esetén vagy autoimmun betegségekben.

Monoklonális gammopatiák Hegyes csúcs (M-spike) a gamma régióban monoklonális gammopátiára utalhat, gyakran plazma sejtes myeloma okozza. A többi gamma fehérje és albumin általában csökkent.

Szérum elektroforézis Napi rutinban alkalmazzuk, különösen fontos magas szérum összfehérje szint esetén. Eset: 80 éves nő, fő panasza igen heves derékfájdalom. Laborok: We:130 (normál<20); CRP:4 (normál <5), osteoporosis nincs. LS gerinc RTG felvételen kompresszió látható. Hematológiai vizsgálat, (további labor és csontvelő vizsgálatok): diagnosis: myeloma multiplex. kezelés előtt kezelés után A beteg kezelést megelőző és 9 hónapos kezelést követő görbéje M komponens redukció jól látható.

Immunelektroforézis Agargélben végzett elektroforézis és kettős immundiffúzió kombinációja.

Immunelektroforézis + + - - + - polivalens immunszérum antiszérum szérumfehérjék 20

Ember (A), egér (B) és patkány (C) szérumának vizsgálata elektroforézissel ember egér patkány 21

Immunelektroforézis Kontrol Beteg

Immunelektroforézis Kontrol Beteg

Immunelektroforézis

Rakétaelektroforézis A precipitációs terület (közelítőleg a csúcsok magassága) arányos az antigén (Ag) koncentrációjával.

Immunfixáció koncentrált vizeletminták + + + Vizelet immunfixációs analízis. AWHS: anti-teljes human szerum antitest. 25x koncentrált vizeletminták. A: erős pozitivitás albuminra, monoklonális lambdalánc. B: Jelentős Bence-Jones proteinuria, k könnyűlánc, enyha albuminuria C: diabetes-indukált nephrosis, albuminuria, poliklonális Ig könnyűláncok koncentrált vizeletminták Az eljárás menete: elektroforézis – immunfixáció (inkubálás antiszérummal) - mosás - szárítás – mosás – festés – mosás - szárítás. A napi rutin részét képezi az immunlaborokban. 26

Immunfixáció denzitometriás értékeléssel egészséges monoklonális gammopathia 27

Turbidimetria és nefelometria Mindkét módszer szolubilis fehérjék vizsgálatára alkalmas, napi rutinban elterjedt. Vizsgálandó antigénre specifikus antitest és az antigén által létrehozott immunkomplex fényszórásán alapul mindkét módszer. Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata. Fényintenzitás csökkenést mérjük. Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése. A szórt fény intenzitását méri.

Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis, immunfixáció: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt rendellenesség (myeloma multiplex, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérje összetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata. Turbidimetria és nefelometria: nagyérzékenységű módszerek oldott fehérjék mérésére.

Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően (2) képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti-immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék (3) segítségével oldhatatlan formában izolálják (4). A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők.

Egy adott betegség diagnózisában a különböző módszereket kombináljuk: pl. Myeloma multiplex

Proteinek detektálására szolgáló további módszerek: Western blot, immunprecipitáció és ELISA (Lásd korábbi gyakorlaton!)

Immunkomplex túltermelődésével járó kórképek

Az SLE példája mutatja a legjobban, hogy az immunkomplexek betegséget okozhatnak. 34 34

Csökkent immunkomplex clearance szerepe SLE-ben immunkomplex (IC): komplement klasszikus út aktiváció FcγRIIa mutáció: IgG2 kötés – gyengébb IC clearance lupus nephritis Antigen FcγRIIIa mutáció: IgG1, IgG3 – IC clearance lupus nephritis 35 35

Szérum betegség A szérumbetegség az immunrendszer reakciója a véráramot elárasztó nagy mennyiségű idegen fehérje ellen. Ezen fehérjék egyik leggyakoribb forrása a ló eredetű vérszérum, mely sok olyan ellenméregnek (antidótumnak) összetevője, melyeket mérges kígyók harapása vagy mérges pókok vagy skorpiók csípése esetén alkalmaznak. A szérumbetegség tünetei közé sorolható a láz, a kiütés és az ízületi fájdalmak (III. típusú hiperszenzitivitás). Ritkán veseelégtelenség és halál is előfordul. Az orvos antihisztaminnal (például difenhidraminnal) és kortikoszteroiddal kezeli a szérumbetegséget.

Natural history of acute serum sickness in rabbits following a single injection of radiolabelled bovine serum albumin (BSA) as antigen. The disease occurs when large quantities of soluble immune complexes are present in the circulation. From Rich RR (1992) Immune complex diseases. In: Wyngaarden JB, Smith LH Jr and Bennett JC (eds), Cecil's Textbook of Medicine, 19th edn, pp. 1467–1470. Philadelphia: WB Saunders. Fever, A szérumbetegség az immunrendszer reakciója a véráramot elárasztó nagy mennyiségű idegen fehérje ellen. Ezen fehérjék egyik leggyakoribb forrása a ló eredetű vérszérum, mely sok olyan ellenméregnek (antidótumnak) összetevője, melyeket mérges kígyók harapása vagy mérges pókok vagy skorpiók csípése esetén alkalmaznak. A szérumbetegség tünetei közé sorolható a láz, a kiütés és az ízületi fájdalmak. Ritkán veseelégtelenség és halál is előfordul. Az orvos antihisztaminnal (például difenhidraminnal) és kortikoszteroiddal kezeli a szérumbetegséget. A ló-vérszérumot nem tartalmazó ellenmérgek általában nem okoznak szérumbetegséget.

Agglutináció

Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis). A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF) jelennek meg.

Az antigén-ellenanyag arány hatása a hemagglutinációra - reakció gyors ülepedés + reakció lassú ülepedés - reakció gyors ülepedés

IgM a leghatékonyabb agglutinin

ellenanyag (antitest) Direkt agglutináció ellenanyag (antitest) vörös-vértest pl. AB0 vércsoport meghatározás

Vörösvértestek hemagglutinációja 1-9- anti birka VVT antitest hígitási sor; kontroll

Az ABO vércsoportantigének szerkezete O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! - + + + - - + + - + - + - - - -

Indirekt agglutináció pl. Rh vércsoport meghatározás

Vércsoport meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Microplate-s meghatározás Ágy melletti gyorsteszt Mikrooszlopos technika Csempés – tesztelendő vérhez folyékony antiszérum (agglutináció) (kétoldalas teszt , ha a beteg szzérumát is hozzáadják ismert vércsop. vérhez) mikroplét – beszárított antitestekkel (agglutináció) mikrooszlop – a hozzáadott vérből keletkező agglutinátum nem centrifugálható le a gélben Gyorsteszt – lemezre szárított anti-A, B, D antitestekkel (agglutinációt figyelik)

A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) FEHÉRJE ANTIGÉN extracelluláris tér citoplazmamembrán intracelluláris tér IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése. 49 49

Passzív agglutináció CRP latex gyorsteszt Rheumatoid faktor latex teszt (Lásd Autoantitestek vizsgálata c.prezentációban.) HCG latex teszt

(diagnosztikai/indikátor módszer) Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Latex Antigén Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF) jelennek meg. RF: rheumatoid faktor

Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? (Nem immunológiai reakció!!!) Virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: pl. ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása Widal teszt (baktériumokat agglutinál a páciens széruma) indirekt agglutináció: pl. anti-D Ea jelenlétének kimutatása * Coombs teszt passzív agglutináció: pl. rheumatoid faktor kimutatása * *További részletek későbbi gyakorlatokon (hiperszenzitivitás, autoantitestek kimutatása)! Widal test: antibodies present in the infected person's blood sample and specific antigens of Salmonella typhi, which produces clumping (agglutination) that is visible to the naked eye. While the method is easy to perform, besides cross-reactivity with other Salmonella species, the test cannot distinguish between a current infection and a previous infection or vaccination against typhoid.

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) 54 54

Immunkomplex túltermelődésével járó kórképek (összefoglalás) Saját antitestek Hyperszenzitivitás II. ABO inkompatibilitás RH inkompatibilitás Hemolitikus anemia Hiperszenzitivitás III. SLE Idegen antitestek Passzív immunizálás: szérumbetegség (Hiperszenzitivitás III.)

Következő hét: Sejttenyésztés Irodalom Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet. Következő hét: Sejttenyésztés Fülöp A. K (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet.