ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás Az áramlási citometria és citométer működésének elve. A minta preparálása. A sejtpopuláció azonosítása méret és granuláltság szerint, scatter plot. Immunfenotipizálás, fluoreszcens jelölés, hisztogram, dot plot. Sejtfelszíni és sejten belüli antigének kimutatása. További alkalmazási területek: sorting, sejtciklus-analízis. Klinikai alkalmazási területek (példákkal): diagnózis, terápia és betegség progresszió monitorozása, prognózis. Gyakorló feladatok. PÁLLINGER ÉVA

A FLOW CYTOMETRIA ELŐNYEI 105-106 SEJT / VIZSGÁLAT 1-2 MIN/ VIZSGÁLAT OBJEKTÍV (+/-) JÓ REPRODUKÁLHATÓSÁG AUTOMATIZÁLT MINTA ELŐKÉSZÍTÉS MIKROSZKÓPIA 102-103 SEJT / VIZSGÁLAT 4-5 MIN/ VIZSGÁLAT SZUBJEKTÍV (+/-) GYENGÉBB REPRODUKÁLHATÓSÁG IDŐIGÉNYESEBB MINTAELŐKÉSZÍTÉS

Mit mond el az áramlási citometria a sejtekről? A relatív sejtméretet (Forward Scatter—FSC) A sejtek relatív granuláltságát ill. belső komplexitását (Side Scatter—SSC) A fluoreszcencia intenzitásukat

Hogyan működik az áramlási citométer? Folyadék rendszer: Biztosítja a sejtek áramlását, a sejteket a gerjesztés helyére fókuszálja Optikai rendszer: 1) fénygerjesztés: laser 2) az emittált fény eljuttatása a fotonsokszorozóhoz (PMT) Elektronikus rendszer: a fényjelek digitális jellé alakítása

Folyadék rendszer Flow cell (áramlási cella) laser sugár Minta felvételi pont sheath flow (burok folyadék ) laser sugár Hidrodinamikus fókuszálás Minta áramlás Flow cell (áramlási cella)

Optikai rendszer A dikroikus filterek szelektíven engedik át a fényt. A fénysugár irányításában és a PMT-be jutó fény „kiválasztásában” van szerepük.

BD Facs Calibur

Milyen kérdéseket tehetünk fel egy áramlási citométernek? Azonosíthatók a sejtpopulációk a vizsgálati mintában? (heterogenitás) Meghatározható a sejtek aktiváltsági, differenciáltsági és érési stádiuma? Jellemezhetjük a sejtek funkcionális állapotát? Meghatározhatjuk a sejtek abszolút számát a mintában? Detektálhatjuk quantitatív módon különféle szolubilis fehérjék jelenlétét a mintában? Fizikailag elválaszthatjuk (szeparálhatjuk) a sejteket egymástól? Válasz: IGEN

Milyen paramétereket használhatunk a kérdéseink megválaszolására? Relatív méret és granuláltság (FSC/SSC) Fluoreszcens jelek a sejtfelszínről és/vagy a citoplazmából Fluoreszcens jelek időbeni detektálása

MEGFIGYELÉSI MÓDOK Sejtszuszpenzió!!! FESTETLEN VIZSGÁLATI MINTÁK ANALÍZISE (sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint) FESTÉS FLUROKRÓMMAL JELZETT MONOKLONÁLIS ANTITESTEKKEL = IMMUNFENOTIPIZÁLÁS (sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján) SEJTALKOTÓRÉSZEKHEZ SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐ FESTÉKEK ALKALMAZÁSA

Mintaelőkészítés Sejtszuszpenzió készítés Erythrolysis Alvadt vérből (alvadékos vérből) nem lehet mérést végezni! Erythrolysis Festés (ha szükséges) Sejtalkotórészek közvetlen jelölése Immunfenotipizálás

Minőség ellenőrzés Technikai Biológiai A készülék beállításának és állapotának ellenőrzése (napi és időszakos) Fluoreszcencia kompenzáció Biológiai A mintaelőkészítés ellenőrzése (pozitív és negatív kontrollok használata) Izotípus ellenanyag jelölés Autofluoreszcencia detektálás

Fényszórási jellegzetességek Right Angle Light Detector (Side scatter parameter = SS) Granuláltság Forward Light Detector (Forward scatter parameter == FS) Sejtméret Light Source (LASER)

Sejtmegoszlás méret és struktúráltság szerint Lymphocyta Basophil granulocyta Monocyta Neutrophil granulocyta Eosinophil granulocyta méret granuláltság

Sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint Válasz: leukémiás csontvelő egészséges csontvelő Milyen eltérést lát a képen, mi okozhatja?

Mi is az a fluoreszcencia? A fluorochrom energiát vesz fel a laser fényből (gerjesztődés)  = 488 nm kibocsátott fluorescens fény Antitest Fényenergia Fluorescens Molecula  = 520 nm HO CO2H O C A fluorochromok kibocsájtják a felvett energiát: A kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, mint a gerjesztő fényé

Emissziós spektrum Wavelength (nm) 400 500 600 700 100% 0% APC PerCP Wavelength (nm) 400 500 600 700 100% 0% Normalized Intensity FITC RPE 800 peridinin chlorophyll A protein Fluorescein isothiocyanate R-Phycoerythrin Allophycocyanin A kibocsátott fény hullámhossza függ: 1) a fluorokróm típusától, 2) a fluorokróm környezetétől

Fluoreszcencia intenzitás (log) Fluoreszcencia Az emittált fluoreszcencia intenzitás arányos a gerjesztett festék molekulák számával FITC FITC Fluoreszcencia intenzitás (log) Sejtszám

A fluoreszcens jelek grafikus megjelenítése Hisztogram Felhő kép (Dot plot)

Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek) SEJTTÍPUSOK Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek) 1. Leukocyta szubpopulációk azonosítása 2. Leukocyták érési / funkcionális állapotának meghatározása „Az immunológia alapjai” TK Függelék 1. táblázat

MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA Differenciálódási markerek FELHASZNÁLÁSA AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK VIZSGÁLATÁBAN: IMMUNFENOTIPIZÁLÁS MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA

Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján IMMUNFENOTIPIZÁLÁS Megválaszolható (biológiai) kérdések: Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) A „pozitív” és a „negatív” populációk %-os megoszlása A sejtek relatív fehérje expressziója Koexpresszió

Lymphocyta alcsoportok Funkcionális és morfológiai (immunfenotípus) kategóriák CD3- CD56+ CD3+ CD19+ gdTCR+ CD4- CD8- CD8+ CD4+ IFNg+ IL-12+ TNFa,b+ IL4+ IL-5+ IL-10+ IL-13+ IL-17+ TGFb+ Ly T B NK Tc Th Th17 Th2 Th1 gdT NKT Plazmasejt ic könnyűlánc+ B1 B2 CD5+ CD25high+ Foxp3+ Treg Kb. ezt kell tudni az év végére.

„Igen-nem” válasz Jelen van-e a vizsgálati mintában a keresett sejttípus? Mekkora arányban van jelen? Mekkora az abszolút mennyisége?

Sejtfelszíni antigén expresszió mértéke CD4high+ CD4dim+ lymphocyta monocyta Azonos mértékben expresszálják-e a vizsgálati minta sejtjei a keresett fehérjét? Mire lehet következtetni az expressziós eltérésekből?

IMMUNFENOTIPIZÁLÁS CD3+/CD8+ CD3+/CD8- CD3-/CD8+ CD3-/CD8- CD3-/CD8+: NK CD3+/CD8-: Th CD3-/CD8-: B, (NK) Milyen sejttípusba tartozhatnak a kettős negatívan festődő sejtek?

KLINIKAI PÉLDA AZ IMMUNFENOTIPIZÁLÁSRA

Myeloma multiplex: a plazmasejtek daganatos megbetegedése Eset leírás: 36 éves férfi minimális traumát követően felkar törést szenvedett. Gyakran fáj a háta, időnként lázas is. Testsúly mérsékelten csökkent az utóbbi időben, változatlan táplálkozási szokások mellett. Fizikális vizsgálat: a láz és a hátfájdalom eredetére utaló jel nem észlelhető. RTG vizsgálat: diffúz osteoporosis a gerinc háti szakaszán Laboratóriumi vizsgálatok: anaemia, hypercalcemia, monoklonális paraprotein.  Iránydiagnózis: Myeloma multiplex Javasolt a csontvelő vizsgálata: kenet, FACS csontvelő Paraprotein = M-protein (lásd következő héten).

B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK Pro B Pre B Éretlen B Érett Aktivált Plazmasejt lymphoid progenitor CD34+ CD19+ CD10+/- ic CD22+ HLA-DR+ TdT+ CD34+/- CD20+ CD10+ ic m + CD21+ CD22+ sIgM+ CD34- CD10- sIgM+/sIgD+ FcR+ CD11b+ sIg+ CD19- CD45- CD38+ sIg- ic k+ v. ic l+ ckit (CD117) + B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK csontvelő antigén-független periféria antigén-függő

A Myeloma multiplex diagnosztikája FACS módszerrel CD45/CD14 CD45/CD38/HLA-DR CD45/CD138 CD10/CD5/CD19 CD34/CD33/CD19 CD22/CD20 Kappa/Lambda/CD19 intracelluláris kappa/lambda CD4/CD8/CD3 KONSZENZUS PROTOKOLL

Csontvelő (FACS) CD45/CD38 jelölés CD38 pozitív CD45 negatív Nagy méretű sejtek

CD45/CD138 jelölés CD45 negatív CD138 pozitív Nagy méretű sejtek

Sejtfelszíni k/l/CD19 jelölés

Citoplazmatikus k/l jelölés Citoplazmában sok l Nagy méretű sejtek Immunfenotípus: CD45-/CD19-/CD38+/CD138+/iclambda+: plazmasejt

REGULATÓRIKUS T SEJTEK Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásával KLINIKAI PÉLDA CD4+/CD25+ CD4+/CD25high+ AKTIVÁLT Th SEJTEK REGULATÓRIKUS T SEJTEK

A sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásának klinikai jelentősége Izotípus kontroll 1. vérvétel 2. vérvétel A monociták HLA-DR expressziójának csökkenése rossz prognózist jelent szeptikus állapotokban.

Technikai vonatkozások Kalibrációs görbe Technikai vonatkozások * M1 y = 1,0076x – 1,6642 r2 = 0,999

Immunfenotipizált sejtek további vizsgálati lehetőségei: sejtszeparálás („sorting”)

Mechanikus szortolás „WASTE” MINTA ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK

Elektrosztatikus szortolás ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK 1 MINTA „WASTE” SEJTEK 2 KONDENZÁTOR ELEKTROMOS TÖLTÉS

Sejtpopulációk jellemzése sejtszeparálás után KUTATÁSI PÉLDA RNS izolálás HDC expresszió Csontvelő CD34+ sejtek

Sejtalkotórészekhez specifikusan kötődő festékek alkalmazása

SEJTCIKLUS ANALÍZIS: PI festés „S” fázis emelkedés malignus sejtekben Propidium jodid (PI) a kétszálú DNS-hez és RNS-hez sztöchiometrikusan kötődő fluorokróm. Alkalmazásával lehetőség nyílik a nekrotikus, az apoptotikus és az ép sejtek elkülönítésére. Klinikai jelentőség: malignus sejtek osztódási képességének jellemzése

A flow cytometria klinikai alkalmazása

Klinikai megközelítés Diagnózis Terápia monitorozás Prognózis Pathológiás állapotok aktivitásának nyomonkövetése

Rutin vizsgálatok célja Sejtarányok és abszolút sejtszámok meghatározása Pathológiás sejtek kvalitatív és kvantitatív analízise Aktivációs markerek kimutatása Sejtciklus vizsgálatok Sejtek funkcionális jellemzése

A flow cytometria helye a rutin klinikai gyakorlatban HEMATOLÓGIAI KÓRKÉPEK IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK Autoimmun betegségek HLA-asszociált betegségek Fertőzések

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN

A malignus haematológiai betegségek diagnosztikája Klinikai tünetek Morfológia Quantitativ és qualitativ vérkép Csontvelő kenet ill. biopszia Cytokémia Flow cytometria, immunhisztokémia Cytogenetika, molekuláris genetika

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN DIAGNÓZIS / DIFFERENCIÁL DG. MARADÉK LEUKAEMIA (minimal residual disease) BETEGSÉG KIÚJULÁS (recidiva) CHEMOTHERÁPIA MONITOROZÁS MULTIDRUG REZISZTENCIA

DIAGNOSZTIKUS SÉMA A LEUKÉMIÁK VISGÁLATÁHOZ AKUT LEUKÉMIA AML, AMML ALL nonT-ALL T-ALL CALLA+ CALLA- CALLA = common acute lymphoid leukemia antigen = CD10 A legfontosabb prognosztikus marker az ALL diagnosztikájában

MULTIDRUG REZISZTENCIA MDR fehérje vizsgálata FACS módszerrel Pgp kimutatás (immunfenotipizálás) Pgp funkcionális jellemzés (pl. Calcein)

FL Aktív pumpa funkció Fluorokrómmal feltöltött sejt sejtszám

IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK CONGENITÁLIS (PRIMER) ŐSSEJT DEFEKTUSOK A TERMÉSZETES IMMUNRENDSZER MŰKÖDÉSI ZAVARAI A HUMORÁLIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI A CELLULÁRIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI SZERZETT (SZEKUNDER) pl. HIV fertőzés

NORMÁL SEJTARÁNYOK VÁLTOZÁSÁNAK DETEKTÁLÁSA IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOKBAN lymphocyta szubpopulációk vizsgálata: CD45/CD14 (quality control: ly kapu tisztasága) CD3/CD19 (T / B arány) CD3/CD56 (T / NK arány) CD8/CD4/CD3 (Tc / Th arány) CD5/CD19 (B1 B, össz B) CD4/CD3/CD45RO (Memória T) sIgM/sIgD/CD19 (naiv B) CD4/CD3/CD45RA (Naiv T) CD4/CD8/CD25 (aktivált T, ill. Treg) k/l /CD19 (B sejt klonalitás) TCR g/d

CD3+/CD4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS VIZSGÁLATOK AIDS-BEN CD3+/CD4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA  PROGNÓZIS IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS

A flow cytometria helye az autoimmun betegségek diagnosztikájában Nem diagnosztikus értékű Jó prognosztikus paraméterek A betegség aktivitásának nyomonkövetése

HLA-ASSZOCIÁLT BETEGSÉGEK Diagnózis alátámasztása Prognosztikus jelentőség Kockázati tényező Leggyakoribb klinikai alkalmazás HLA-B27 expresszió vizsgálata perifériás leukocitákon (Bechterew)

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A FERTŐZÉSES ÁLLAPOTOKBAN Az immunrendszer válaszkészségének monitorozása VÍRUS FERTŐZÉSEK: CD4/CD8 ARÁNY CSÖKKEN BAKTERIÁLIS FERTŐZÉSEK : ABSZOLÚT CD4+ és CD8+ T SEJT SZÁM CSÖKKENÉS SZEPSZIS CD14DIM/CD16HIGH/HLA-DR+/CD4+/CR1+ MONOCYTA SZUBPOPULÁCIÓ NŐ CD14+/HLA-DR+ MONOCYTA CSÖKKEN T SEJT AKTIVÁCIÓ NYOMONKÖVETÉSE T SEJT APOPTÓZIS MEGHATÁROZÁSA

FUNKCIONÁLIS TESZTEK

Sejtfunkciók vizsgálata autoimmun betegségekben A BETEGSÉG AKTIVITÁSÁNAK NYOMONKÖVETÉSE Th1/Th2 sejtarány kimutatása az intracelluláris citokinek detektálásával Szolubilis citokinek kimutatása testnedvekben (mikrogyöngy módszer)

Intracelluláris citokin kimutatás Milyen sejtpopulációk láthatók az ábrák bal felső részén?

Szolubilis citokin kimutatás Y * mikrogyöngy Y Citokint felismerő ellenanyag 1. * Fluorokrómmal jelzett citokint felismerő ellenanyag 2. Citokin Melyik korábban tanult módszerhez hasonlít?

Sejtfunkciók vizsgálata immunhiányos állapotokban FAGOCITA KÉPESSÉG VIZSGÁLATA (FLUOROCHROMMAL JELZETT PARTIKULUMOK FELVÉTELE) ROI TERMELÉS VIZSGÁLATA

Fagocita képesség vizsgálata

ÖSSZEFOGLALÁS

A FLOW CYTOMETRIA ABSZOLÚT INDIKÁCIÓS TERÜLETEI Malignus hematológiai betegségek diagnosztikája és differenciáldiagnosztikája Minimális reziduális betegség kimutatása Multidrug rezisztencia vizsgálata Csontvelő transzplantáció nyomonkövetése AIDS

A FLOW CYTOMETRIA RELATÍV INDIKÁCIÓS TERÜLETEI Autoimmun betegségek aktivitásának nyomonkövetése HLA-asszociáció kimutatása Fertőzések nyomonkövetése Sejtciklus analízis Sejtfunkciók detektálása Receptro expresszió kimutatás

Irodalom: Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet. Falus A, Buzás E., Rajnavölgyi É. (Szerk.): Az immunológia alapjai, 14.5-6. fejezet Következő hétre: Immunszerológia Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet.

Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában? Fakultaív gyakorlás Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában? Mi a diagnózis?

PRE-PRO B SEJTEK: CD34+/CD10+/CD19+ 1. PRE-PRO B SEJTEK: CD34+/CD10+/CD19+

2. Homogén ly-blaszt populáció Granulocyta kevés CD45dim+/HLA-DR+

2. CD34+/CD33+

2. CD45dim+/HLA-DR+/ CD34+/CD33+/CD7+  AML CD7+/CD13+

3. Ly populáció  Sok HLA-DR+ ly

3. Ly kapun belül sok CD19+/CD5+ B1 B sejt

3. A CD19+ B sejtek lambda könnyűláncot expresszálnak (klonális felszaporodás)

CD45+/CD19+/CD5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+ 3. CD45+/CD19+/CD5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+  B-CLL

Animált tutorial http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html