IMMUNSZEROLÓGIA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ

Agglutináció és precipitáció precipitáció, immunkomplex képződés agglutináció

Immunkomplex és precipitátum antitest antigén Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

Szisztemás lupus erythematosus számos szervet megbetegíthet immunkomplexek szerepe Szív Pleura, pericardium Vese komplikációk terhesség során Bőr Szervet veszélyeztetheti Az SLE példája mutatja a legjobban, hogy az immunkomplexek betegséget okozhatnak. Általában enyhébb Ízületek Erek, FVS, VVT, PLT Központi idegrendszer Wallace in Arthritis and Allied Conditions, 13th Ed V2, p1319, Koopman, ed

Csökkent immunkomplex clearance szerepe SLE-ben immunkomplex komplement klasszikus út aktiváció FcγRIIa 131aa hisztidin/arginin IgG2 kötés gyengébb – IC clearance lupus nephritis FcγRIIIa 176aa valin/fenilalanin IgG1, IgG3 – IC clearance lupus nephritis

Precipitációs görbe EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő antigén mennyiség ellenanyagtúlsúly sok csapadék antigéntúlsúly kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

MÓDSZEREK Immundiffúzió: (agargélben, antigén, antitest precipitációs reakcióján alapul) - radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra elektroforetizálják) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

Immundiffúziós módszerek poliklonális ellenanyag agaróz gélbe keverve Meghatározandó antigén az agarba vájt lyukakban pl. immunglobulin meghatározásra használható A kör területe arányos az mért fehérje koncentrációjával. az antigén és az ellenenanyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi

Radiális kettős immundiffúzió Immundiffúziós módszerek Az antigént tartalmazó lyuktól egyenlő távolságra elhelyezett ellenanyagok különböző koncentrációban. Az antigén és az ellenananyag találkozása precipitációs ív kialakulását eredményezi, ebből az ellenanyag koncentrációra következtethetünk. Fordítva, az antigén koncentráció meghatározására is alkalmas a módszer. jobb oldali 3 ábra: fent: 1 és 1 antigén azonos középen: 1,2,3 különböző antigének alul: 1 és 2 részben azonos, de a 2-n van legalább egy olyan epitop ami az 1-en nincs (ezért a „sarkantyú”) Radiális kettős immundiffúzió Antigének közös determinánsainak vizsgálata 9

Szérum elektroforézis

Szérum elektroforézis

Szérum elektroforézis Napi rutinban alkalmazzuk, különösen fontos magas szérum összfehérje szint esetén. Eset: 80 éves nő, fő panasza igen heves derékfájdalom. Laborok: We:130 (normál<20); CRP:4 (normál <5), osteoporosis nincs. LS gerinc RTG felvételen kompresszió látható. Hematológiai vizsgálat, (további labor és csontvelő vizsgálatok) diagnosis: myeloma multiplex. kezelés előtt kezelés után A beteg kezelést megelőző és 9 hónapos kezelést követő görbéje M komponens redukció jól látható.

Immunelektroforézis Agargélben végzett elektroforézis és kettős immundiffúzió kombinációja.

Immunelektroforézis Immunprecipitáció - - + + - + polivalens immunszérum antiszérum - + szérumfehérjék Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. 14

Immunelektroforézis

Rakétaelektroforézis a precipitációs csúcsok magassága arányos az AG koncentrációjával

Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt rendellenesség (myeloma multiplex, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérje összetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata.

Immunfixáció koncentrált vizeletminták + + + Vizelet immunfixációs analízis. AWHS: anti-teljes human szerum antitest. 25x koncentrált vizeletminták. A: erős pozitivitás albuminra, monoklonális lambdalánc. B: Jelentős Bence-Jones proteinuria, k könnyűlánc, enyha albuminuria C: diabetes-indukált nephrosis, albuminuria, poliklonális Ig könnyűláncok koncentrált vizeletminták Az eljárás menete: elektroforézis - fixálás ill. inkubálás antiszérummal- szárítás – festés. A napi rutin részét képezi az immunlaborokban. 18

Immunfixáció denzitometriával egészséges monoklonális gammopathia 19

Turbidimetria és nefelometria Mindkét módszer szolubilis fehérjék vizsgálatára alkalmas, napi rutinban elterjedt. Vizsgálandó antigénre specifikus antitest és az antigén által létrehozott immunkomplex fényszórásán alapul mindkét módszer. Napi rutinban is alkalmazott vizsgálatok. Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata. Fényintenzitás csökkenést mérjük. Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése. A szórt fény intenzitását méri.

Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis). A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF) jelennek meg.

Az antigén-ellenanyag arány hatása a hemagglutinációra - reakció gyors ülepedés + reakció lassú ülepedés - reakció gyors ülepedés

ellenanyag (antitest) Direkt agglutináció ellenanyag (antitest) vörös-vértest pl. AB0 vércsoport meghatározás

Vörösvértestek hemagglutinációja 1-9- anti birka VVT antitest hígitási sor; kontroll

Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! - + + + - - + + - + - + - - - -

Indirekt agglutináció pl. Rh vércsoport meghatározás

Vércsoport meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Microplate-s meghatározás Ágy melletti gyorsteszt Mikrooszlopos technika Csempés – tesztelendő vérhez folyékony antiszérum (agglutináció) (kétoldalas teszt , ha a beteg szzérumát is hozzáadják ismert vércsop. vérhez) mikroplét – beszárított antitestekkel (agglutináció) mikrooszlop – a hozzáadott vérből keletkező agglutinátum nem centrifugálható le a gélben Gyorsteszt – lemezre szárított anti-A, B, D antitestekkel (agglutinációt figyelik)

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

Direkt Coombs teszt "pozitív" eredmény: (DAT) betegből Direkt Coombs teszt "pozitív" eredmény: a vvt-hez kapcsolódott antitestek jelenlétét jelzi. iwannabeadr.com/.../mod/resource/view.php?id=116

Direkt antiglobulin teszt Mikro-oszlop teszt http://www.sanquin.nl/Sanquin-eng/Serology.nsf/All/Cellbind-Presentation.html

Mikro-oszlop agglutinációs teszt http://www.sanquin.nl/Sanquin-eng/Serology.nsf/All/Cellbind-Presentation.html

Várandós anyának/ recipiensnek indirekt antiglobulin teszttel lehet az vvt antigén elleni antitestjeit mérni Rh+ sejtek Anyai szérum iwannabeadr.com/.../mod/resource/view.php?id=116

Passzív agglutináció CRP latex gyorsteszt Rheumatoid faktor latex teszt HCG latex teszt

(diagnosztikai/indikátor módszer) Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF) jelennek meg. RF: reumatoid faktor

Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? (Nem immunológiai reakció!!!) Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: pl. ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása Widal teszt (baktériumokat agglutinál a páciens széruma) indirekt agglutináció: pl. anti-D Ea jelenlétének kimutatása Coombs teszt passzív agglutináció: pl. rheumatoid faktor kimutatása