Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika Az endotélsejtek aktivációjának tanulmányozása aktivációs mintázat segítségével Dr. Cervenak László Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium Elméleti PhD Iskola Kurzusa- Molekulától a betegágyig, sejttől a szervezetig 2011/2012 Tanév

Kettős cél Az endotélsejtek szerteágazó működése A mintázat keresés, mint kutatási stratégia

Mit jelent a sejtaktiváció? Ehhez megelőzőleg nyugalomban kell lennie egy sejtnek!!! A legtöbb sejttípusnak van egy adott funkciója, tehát soha nincs nyugalomban Fehérvérsejteknél, bizonyos őssejteknél jól használható fogalom Más sejteknél inkább működésváltás lenne a helyesebb kifejezés Mai használatban az aktiváció sokszor ezt a működés-váltást jelenti

Endotélsejtek Gerincesekben jelentek meg 450-500 millió éve 6*1013 db 1 kg össztömeg 6 teniszpályányi felület Minden erünket (beleértve a nyirokereket és a szívet is) endotélsejtek borítják Jelentős morfológiai és funkcionális diverzitás az ér típusa (artéria, véna, venula, kapilláris, nyirokér) és az ellátott szerv (agy, máj, vese, stb.) szerint Környezeti és epigenetikus tényezők alakítják a diverzitást Ateroszklerózisnál Russel Ross óta ismert az endotél diszfunkció kifejezés

Endotél sejtek által szabályozott folyamatok Simaizom tónus (vérnyomás) Kontrakció Relaxáció Érszerveződés Endotél, simaizom, pericita proliferáció, migráció Permeabilitás- Permszelektivitás Szoros illeszkedés Intercelluláris rések Szérumfehérjék metabolizmusa Felvétel / lebontás Recirkularizáció Endotél sejtek által szabályozott folyamatok Immunválasz Homing Ag-prezentáció Citokin termelés Trombózis Koaguláció TC aggregáció Trombolízis Érrendeződés: saját, simaizom és ECM szabályozás Simaizom tónus szabályozás ≠ Vérnyomás szabályozás Leukociták átjutása ≠ laza illeszkedés Adhézió Gördülés Megtapadás Transzmigráció Gyulladás Kemotaxis Adhézió Leukocita aktiváció

Sejtaktiváció ≠ diszfunkció Diszfunkcionális endotél TNF- IL-1,6,8- TF, vWf Adhézió- VE-Cadherin+ MHC II- PDGF- TXA2- PGI2+ eNOS szabályozó funkció kiesés NO Aktivált endotél Kevés NO Simaizom tónus  Simaizom proliferáció Leukocita adhézió/aktiváció Trombocita adhézió/aktiváció Gyulladás beindulása Sok NO Peroxinitrit (nitrozatív stressz) Proliferációs út TNF IL-1,6,8 TF, vWf Adhézió VE-Cadherin MHC II PDGF TXA2 PGI2 Véralvadási út Ateroszklerózisnál Russel Ross óta ismert az endotél diszfunkció kifejezés Gyulladási út (NFkB) Nyugvó endotél NO

Mi az az aktivációs mintázat? Sok, az adott sejtre specifikus fenotípus marker egyidejű vizsgálatából összeálló kép In vivo Csak a mintavételezés „in vivo”, a mérés lehet a valamilyen laboratóriumi módszer is In vitro Már maga az aktiváció is in vitro sejtkultúrában történik Az említett mRNS chip vizsgálat arra a meglepő eredményre jutott, hogy mindössze csak 18 gén változott azonosan a 3 faktor hatására 81 gén közül. Mivel az eredmények hátterében állhatnak szignalizációs különbségek is, lapozz!

In vivo endotélsejt fenotípus mintázat Képalkotók Egyéb mérések Szérum/plazma faktorok CT, MRI, ultrahang, angiográfia stb. NO és végtermékeinek kimutatása vizeletből, kilélegzett levegőből FMD Szolúbilis adhéziós molekulák, koagulációs faktorok, vazoaktív anyagok Intravitális mikroszkópia, mikroszkóp CT Keringő endotélsejtek és progenitorok

In vivo endotélsejt fenotípus mintázat NO végtermékek NO2-, NO3- Lipid mediátorok PGI2, PGD2, PGE2, LTB4, TXA2 Vazoaktív peptidek ET-1, ET-3 Koagulációs faktorok VWF, TM, THBS, TF, TFPI Fibrinolitikus rendszer tPA, uPA, PAI-1 Mátrix komponensek Kollagén IV, fibronektin, laminin Szolúbilis adhéziós molekulák sICAM-1, sICAM-2, sVCAM-1, sP-Selectin, sE-Selectin, sPECAM-1, sVE-Cadherin, sZO-1 Citokinek IL-1a, IL-1ra, IL-6, IL-8, MCP-1, TNFa Mérhetőség Specificitás Relevancia

In vitro endotélsejt fenotípus mintázat Több száz mérhető paraméter, több tucatnyi módszerrel Példa: Gyulladási faktorok összehasonlítása endotélsejt aktiváló képességük szerint Lipopoliszaccharid (LPS) Tumornekrózis faktor-a (TNFa) Interleukin-1b (IL-1b) Gyulladási citokinek termelése Adhéziós molekulák expressziója ROS termelés

Az LPS, TNFa és IL-1b génexpressziós mintázata 15 3 30 TNFa LPS 18 2 7 Az említett mRNS chip vizsgálat arra a meglepő eredményre jutott, hogy mindössze csak 18 gén változott azonosan a 3 faktor hatására 81 gén közül. Mivel az eredmények hátterében állhatnak szignalizációs különbségek is, lapozz! 6 IL-1b *Zhao B., et al. 2003. American Journal of Physiology, 284:C1577

Gyulladási aktivációs mintázat Kérdés: Jelátviteli, fehérjeexpressziós és funkcionális szinten is lehet-e találni különbséget köztük? Az említett mRNS chip vizsgálat arra a meglepő eredményre jutott, hogy mindössze csak 18 gén változott azonosan a 3 faktor hatására 81 gén közül. Mivel az eredmények hátterében állhatnak szignalizációs különbségek is, lapozz!

Gyulladási aktivációs mintázat LPS TNFa IL-1b Az említett mRNS chip vizsgálat arra a meglepő eredményre jutott, hogy mindössze csak 18 gén változott azonosan a 3 faktor hatására 81 gén közül. Mivel az eredmények hátterében állhatnak szignalizációs különbségek is, lapozz! Kontroll 3 perc 15 perc 60 perc

Gyulladási aktivációs mintázat

Gyulladási aktivációs mintázat p38 MAPK JNK Akt

Gyulladási aktivációs mintázat TLR4 VE-Cadherin Mag A TLR-4 lokalizációja a mintázat alapján derült ki TLR4 Golgi

Gyulladási aktivációs mintázat IL-6 IL-8 MCP-1

Gyulladási aktivációs mintázat E-Selectin ICAM-1

Endotélsejt aktivációs mintázat IL-1b TNFa LPS NFkB p38 JNK NFkB p38 JNK Akt Ca-szignál E-Selectin ICAM-1 IL-6 IL-8 MCP-1 Erősség Sebesség Endotélsejtekre jellemző mintázat, faktorokra jellemző mintázat, kimenő jelekre jellemző mintázat. Példa: NFkB vs. IL-6

Mintázat keresés, mint stratégia Átlátható mennyiségű adat Irodalmi háttér Hagyományos és bioinformatikai elemzés (LAD analízis) Genomika Transzkriptomika Proteomika Metabolomika stb. Hipotézis alapú vizsgálatok Kevés adat Irodalmi háttér Hagyományos statisztikai elemzés omika: nincs sok repeat, idő-, cc-függés Extrém adatmennyiség Bioinformatikai elemzés

Mikor használható? Omikai vizsgálatok megerősítése A sejtekre ható hasonló hatásmechanizmusú faktorok finom különbségeinek felderítése Betegségek patomechanizmusának vizsgálata

Köszönöm a figyelmet!