Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely

Előadás vázlat Definíció Történeti áttekintés A műszer alapvető felépítése Mérhető paraméterek Alkalmazási területek Orvosi diagnosztika Mérések értékelése Ipari felhasználás Kutatás és gyógyszerfejlesztés

Mit jelent? Az áramlási citometria egy módszer,mely során… folyadékban szuszpendált sejtek / részecskék áramolnak egyesével egy fényforrás előtt, ami alapján azok fizikai és / vagy kémiai tulajdonságaira következtethetünk a generált jelek detektálásával és elemzésével.

Az áramlási „partikulometria” kezdetei: 50-es évek Elmqvist / Sweet tintasugaras nyomtató: tintacseppek áramoltatása, számlálása Wallace H. Coulter (1913-1998) Coulter számláló: sejtek analízise áramló folyadékban „Vérkép”-elemzés

Az citometria fejlődése: Becton & Dickinson: FACScan Herzenberg : - szorter funkcióval ellátott flow cytometer (1975) - FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter

Legújabb típusú készülékek: Több lézer, detektálási hullámhosszsáv Hordozható „Megfizethető” ár: 12m Ft BD Accuri BD FACSVerse Összes elérhető laser-t tartalmazza Teljesen automatizált működés 96 well plate mintaadagoló

Alapvető felépítés Áramlási kör: Fényforrás: Detektorrendszer Tartályok Csőrendszer Filterek Áramló köpenyfolyadék: PBS Fényforrás: Argon (488nm) laser / He- Ne (635nm) laser / He- Cd (325nm) laser/ UV Detektorrendszer Analóg-Digitális átalakító Számítógép + Software

Mérhető paraméterek Fluoreszcencia: Side scatter (SSC) = laser által gerjesztett fény, melyet fluoreszcens festékek által jelzett részecskék emittálnak Side scatter (SSC) ≈ partikulum granularitás Forward scatter (FSC) ≈ partikulum méret

Detektálási lehetőségek Sejt / részecske: natív mérés FSC, SSC Felszíni antigének Szekunder AT - Fluoreszcens festék Antitestek, citokinek Adszorbens gyöngy + szekunder AT- Fluoreszcens festék

Fluoreszcens festékek

Miért jó / nem jó? ELŐNYÖK Sok részecske gyors analizálása Sejt sub-típusok kvantitatív meghatározása Natív mérés: olcsó Egyszerre több paraméter mérése HÁTRÁNYOK Karbantarás: körülményes, drága Fluoreszcens festékek, AT-k drágák (pl. FITC kötött AT: 100-150e Ft / ml) Méretkorlát: 0,3 és 150 μm

Mire jó / nem jó? MÉRHETŐ Sejtek / 300nm feletti részecskék Hozzávetőleges méret, granuláltság Sejtfelszíni marker, DNS tartalom, ionáramlás, antitestek, citokinek (FL szek. AT és adszorbens gyöngyök közvetítésével) NEM MÉRHETŐ 300nm alatti vagy 150 μm feletti részecskék Pontos méret, szerkezeti felépítés Morfológia

Lehetséges alkalmazási terültek Orvosi diagnosztika Infektológia Immunológia / Allergológia Hematológia Onkológia Gógyszerkutatás Immunogenitás vizsgálata Gyógyszerhatás felmérése Szerkezeti analízis

Elérhető rutin-laboratóriumi vizsgálatok Vérkép CD4/CD8 sejtarány Th1/Th2 arány NK funkció, arány HLA-B27 meghatározás Immunglobulin szint meghatározás DNS tartalom és sejtproliferáció vizsgálata Bazofil aktivációs teszt Leukémia és limfóma „panel”-ek

DD.: Infektologia Teljes vérkép meghatározása Kalibrált automata: pl. Abbot Cell-Dyn 3500 Multi-Angle Polarized Scatter Separation 0° : sejtméret 10° : sejtszerkezet és komplexitás 90° polarizált: nukleáris lebenyezettség 90° depolarizált : eosinophilek differenciálása

DD.: Infektologia Fehérvérsejtszám: Fiziológiás: Neu: 2000-7500/ µL Ly: 1500-4000/µL Bakeriális inf: Neu: ↑↑↑ Ly: - Virális infekció: Neu: - Ly: ↑↑↑

Immunologia T-sejt meghatározás SEJT Citotoxikus T Th1 Th17 Tfh Treg Károsító hatás Transzplant. rejekció Autoimmun betegségek Allergia Felszíni markerek CD8 CD4 CXR3 CCR6 CXR5 CD25 CCR4 Citokinek IFN-G, TNF TNF, IL17,-21,-22, -26 IL 21 TGF-B, IL 10 IL 4,-5,-6,-13 IL 9,-10

Immunologia T-sejt meghatározás CD4 CD8 CD3 CD3

Immunologia T-sejt meghatározás: Citotoxikus T T helper CD8 CD4 CD3

Immunologia Basophil aktivációs teszt: Aktivációs marker: CD63 pl. krónikus idiopátiás urticaria diagnózisa

Onkologia DNS tartalom analízis Elmélet: Gyakorlat: Tumoros sejtek DNS tartalma nagyobb Nagyobb S és G2/M arány Gyakorlat: Sejt permeablitiásának fokozása DNS tartalom festése: propidium jodid – fokozza a fluoreszcenciát!

Haematologia Leukaemiák és limfómák DD. Sejtfelszíni markerek alapján Utánkövetés: Minimális Reziduális Betegség (MRD) Retikulocytaszám meghatározás: Anaemia DD.

ALL VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓) ( + ↑ LDH, karbamid, sülly.; periférián blasztok, máj-, vesefunkc. eltérések) Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! B-sejt: CD 10, 19, 20, 22 T-sejt: CD 2, 3, 5 Differenciálatlan: TdT; (HLA-DR; CD34) Gyors fenotipizálás citometriával!

ALL B-sejtes T-sejtes Pre-pre-B: + :TdT; CD19, -34; HLA-DR Pre-B: + : TdT; CD19; cyIgM; (CD10) Burkitt-ALL: + : CD19; SIgM; κ/λ; (CD10) - : CD34; HLA-DR Korai T: + : TdT; CD7; cyCD3 - : CD1 Átmeneti- T: + : TdT; CD1, -7 érett-T: + : SCD3; CD7; (TdT) Differenciálatlan: +: TdT; (HLA-DR; CD34)

AML VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓) Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! Myelocyta markerek: CD13, -33; cyMPO Monocyta markerek (M4,M5): CD14 Thrombocyta markerek (M7): CD41, -42, -61 Citometria! 2006-os Bethesda beosztás: CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLA Dr

AML CD45 vs. SSC kapuzás: felismerhetők a myeloblastok

M0 / M1 / M2 AML (Myelocyta)

M3 AML (promyelocyta)

M4 / M5 AML (monocyta)

M6 AML (erythrocyta)

M7 AML (megakaryocyta) CD 42b CD 41

Ipari felhasználás Ivóvízben, fürdővízben baktériumok gyors kimutatása Kalibrált automaták, gyors és olcsó analizálás Nagy mintaszám ellenőrzése Borászatban megfelelő élesztőkoncentráció mérése Tenyészállat nemzőképességének felmérése ivarsejtek számlálása DNS festés segítségével a viabilitás felmérése

Alkalmazás a kutatásban, gyógyszerfejlesztésben Intracelluláris enzimek és ionok koncentrációjának mérése Membránpotenciál mérése DNS tartalom, sejtproliferáció, apoptózis vizsgálata MDR mechanizmusának vizsgálata Immunogenitás Aggregációvizsgálat In vivo és képalkotóval kombinált vizsgálatok

Ionkoncentrációk mérése Indikátor alkalmazása: sejtbe áramlik → hidrolizálódik → → nem jut át a sejtmembránon → intracellulárisan felhalmozódik SBFI – Na+ PBFI – K+ FURA-2, INDO-1, Fluo-3 – Ca2+ BCECF – pH

Membránpotenciál mérése Oxanol Membránpotenciálnak megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán Depolarizáció hatására nő az intracelluláris oxanol mennyisége → fluoreszcencia fokozódik

Gyógyszerkutatás: MDR vizsgálata Calcein festék, amely intracellulárisan felhalmozódik MDR pumpák a sejtből eltávolítják Intracelluláris jelenlétével arányosan változik a sejt fluoreszcenciája

Gyógyszerkutatás Apoptózis vizsgálata Plazmamembrán változások: ANNEXIN V szintje emelkedik FITC konjugálva mérhető DNS fragmentáció Propidium jodidos festés: korai, késői apoptotikus sejtek és nekrotikus törmelék elkülönítése

Immunogenitás vizsgálata Poliklonális és specifikus monoklonális antitestek vizsgálata Kvantitatív meghatározás IgA, IgE, IgM, IgG szintek mérése Módszer: multi-bead array Gyöngyökhöz kötött antitesek vizsgálata szekunder, fluoreszcens antitestekkel

Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata Szupravezikuláris struktúrák vizsgálata liposzómális oldatokban Szabad-gyógyszer koncentráció hatásainak vizsgálata a liposzómális-gyógyszer stabilitására és aggregálódására

Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata PBS puffer (A), lejárat előtti Caelyx (B), lejárat utáni Caelyx (C)

Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata A: lejárat előtti Caelyx közvetlenül felbontás után B: lejárat utáni Caelyx C: lejárat előtti Caelyx nyitás után percekkel újra mérve

A jövő lehetőségei ZÁRT RENDSZEREK: Imaging flow cytometry Morfológiai anamnézist is lehetővé tesz: az áramló részecskékről képfelvétel készül NYÍLT RENDSZEREK: LSC: Laser scanning cytometry Tárgylemezen lévő sejtek analízise: morfológiai elemzés és fluoreszcencia rögzítése In vivo citometria Tumorsejtek intravasális nyomonkövetése

Összegzés Az áramlási citometria alkalmas sok részecske gyors és többparaméteres kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára Alkalmazása széleskörben elterjedt, a mindennapi orvosi diagnosztikától, az alapkutatás számos területén át, az ipari felhasználásig. Különböző igényeknek megfelelően számos műszer működik ezen az elven, ami a teljesen automatizált analízist is lehetővé teszi Ez egy érdekes és hasznos módszer, amivel érdemes foglalkozni!

Köszönöm a figyelmet!