IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT-MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) - Régi, megbízható módszerek - sok közülük most is használatban van Olcsó (gyakran szemmel látható az eredmény mindenféle kémiai reakció nélkül) Ag-Ea kölcsönhatásokat, epitop (Ag determináns) fogalmát segít megérteni

AZ IgG TÉRSZERKEZETE A hinge régió flexibilitásának köszönhetően változatos sztérikus viszonyok között is képes az antigénhez kötni, sőt bivalenciájának köszönhetően akár két antigént is „összefogni”.

Az ellenanyag izotípusok és az antigénkötőhelyek száma

Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos kölcsönhatásokon alapuló módszerek SZEROLÓGIAI REAKCIÓK Ag-EA nem kov. kölcsh. Immunkomplex Két azonos kötőhellyel rendelkező (bivalens Ea) két Ag-t kapcsol össze 1. Precipitáció oldott Ag + Ea (immunkomplex) oldhatatlan precipitátum Agglutináció részecske természetű Ag + Ea nagyméretű aggregátumok (sejtek) 2. komplement rendszer aktiválódása Komplement-függő lízis

Precipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos kölcsönhatásokon alapuló módszerek Precipitáció nagy Ag felesleg kicsi oldható kevés immunkomplexek csapadék szabad Ag megfelelő Ag-Ea nagy sok csapadék immunkomplex nincs szabad Ag és Ea nagy Ea felesleg kevés csapadék szabad Ea EKVIVALENCIA PONT: Az az Ag-Ea arány, amelynél maximális precipitáció érhető el:

Precipitációs görbe ellenanyagtúlsúly EKVIVALENCIA antigéntúlsúly (animált ábra) Precipitációs görbe ellenanyagtúlsúly EKVIVALENCIA antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

Precipitációs görbe EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő antigén mennyiség ellenanyagtúlsúly sok csapadék antigéntúlsúly kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. (animált ábra) Precipitáció IMMUNKOMPLEX (≠ PRECIPITÁTUM) Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: -valencia (kapcsolatteremtő képesség) mono-, bi-,…, poli-valens hőmérséklet pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG az oldékonyságot csökkenti)

MÓDSZEREK Immundiffúzió: (lágy gélközegben) - radiális egyszerű (Ea-t v. Ag.-t keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű Ag-t elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (Ea-t gélbe keverik, Ag-t elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tul. alapján szétválasztott frakciókat ellenanyagtartalmú gélen újra elektroforetizálják.) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció

Radiális kettős immundiffúzió (Ouchterlony módszer ) 1. kicsapódott fehérje sávok Festés után: 1000 500 250 125 67.5 33.7 BSA koncentráció (μg/ml) OVA MSA BSA BSA immunizált nyúl szérum BSA és OVA immunizált nyúl szérum

Radiális kettős immundiffúzió Az antigénekről nem csak mennyiségi információt kaphatunk, hanem egyszerűbb jellemzést is (Ouchterlony módszer ) 2. A és B azonos A és B különböző A B A B poliklonális ellenanyagok poliklonális ellenanyagok A és B részben azonos A B poliklonális ellenanyagok

Immunelektroforézis Az immunprecipitáció - - + + - + polivalens immunszérum antiszérum - + szérumfehérjék Az immunprecipitáció (Nem klasszikus szerológiai reakció!!!) Az AG-EA kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti-immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. (analóg az 1. gyak affinitás oszlopával)

Olcsó, megbízható diagnosztikus módszerek! Pl. gammopátiák diagnosztikája: M (mielóma) komponens kimutatása zónaelektroforézis és immunoelektroforézis segítségével Nagyméretű üveglemezre öntött immunelektroforézis gél: - 7 lukkal a minták és a standardok számára - 6 vájattal az immunszérumok számára

Rakéta elektroforézis (mennyiségi becsléshez) (gélben ellenanyag, lukakban antigén) standard sor minták 1.lépés: „zónaelektroforézis” 2.lépés: 90o elforgatva immunelektroforézis az anti-szérumot pl. szűrőpapírba itatva fektetik a gélre

Agglutináció A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel reagáló ellenanyagok a sejtek összecsapódását, agglutinációját idézhetik elő. Nem oldott anyagok reagálnak az ellenanyagokkal, hanem mikroszkópos méretű struktúrák: pl. sejtek, latexgyöngyök, Direkt sejtfelszíni antigénnel reagáló ellenanyagok kötődését követően a sejtek összecsapzódnak Indirekt Ha valamilyen okokból (pl. Ag determinánsok elrendeződése vagy a koncentráció viszonyok) nem jöhet létre a sejtek direkt agglutinációs összecsapódása, az antigénekhez kötött Ea-okat kötő második ellenanyag váltja ki az agglutinációt Passzív Mérési/diagnosztikai céllal vörösvérsejtekhez vagy latex gyöngyökhöz mesterségesen antigének kapcsolhatók, és így az ezekre specifikus Ea-gal agglutináltathatók. Az agglutinációnak szemmel látható eredménye van – nincs szükség komplikált kémiai reakciókra, drága enzimekre az elvégzéséhez

Diagnosztikus módszerként sok területen használják őket A direkt, indirekt és passzív hemagglutináció áttekintése haptén v. Ag spec. Ea „inkomplett Ea” pl. AB0 vcs. Ag szekunder Ea Diagnosztikus módszerként sok területen használják őket

(pl. AB0 vércsoportok között) (animált ábra) Direkt agglutináció (pl. AB0 vércsoportok között)

(animált ábra) nincs agglutináció

Indirekt agglutináció (klasszikus példa: Rh avagy D vércsoport meghatározáskor)

(animált ábra) Passzív agglutináció 1. Az antigén specifikus ellenanyagok jelenléte kimutatható vele Pl. Reumatoid Artrítisz diagnosztikájánál

Passzív agglutináció 2. az agglutináció gátlása szabad antigénnel (animált ábra) Passzív agglutináció 2. az agglutináció gátlása szabad antigénnel Egy ismeretlen mintában kimutatható az antigén jelenléte Kisméretű, egyetlen antigén determinánssal rendelkező antigének agglutinációval történő kimutatása is lehetséges így (pl. haptének) (ismeretlen minta hozzáadása) Ha szabad antigén van jelen a mintában  nincs agglutináció pl.: Monoteszt terhesség kimutatási eljárás

Hemagglutináció Ea-ok jelenléte nélkül? (animált ábra) Hemagglutináció Ea-ok jelenléte nélkül? igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz vírus ellenes Ea kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptorkötést is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

Az Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) A struktúrája miatt az ellene termelődő IgG típusú ellenanyagok direkt agglutinációt nem tudnak kiváltani („inkomplett ellenanyag”) de emberi Ig-okkal reagáló 2. Ea-gal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MØ –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározás tiphoid láz kimutatása (Widal teszt – a baktérium agglutinációja az érintett személy szérumával) indirekt agglutináció: anti-D Ea jelenlétének kimutatása Coombs teszt passzív agglutináció: rheumatoid arthritis kimutatása

Az antigén-ellenanyag arány hatása az agglutinációra

Szérum komplement aktivitás titrálása Y komplementek a humán szérumban növekvő mennyiségű humán szérum Szérum komplement aktivitás titrálása hemolízis

KONTROLL KÍSÉRLETEK Y ozmolízis hőinaktivált fiziológiás humán szérum sóoldat desztillált víz ozmolízis

KOMPLEMENT KIMERÍTÉS Y 1 2 csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag felülúszó csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag komplement a humán szérumban BSA anti-BSA ellenanyag KOMPLEMENT KIMERÍTÉS növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó

Makrofágok mononukleáris fagocitarendszer sejtjei differenciálódás, aktiválódás során: - adherencia nő, - migrációs képesség nő, - gyulladási mediátorok szekréciója nő, - Ag-felvétel, feldolgozás T-sejt aktiváló képesség fokozódik, hatékonyabb fagocitáló- és mikrobaölő képesség. FAGOCITÓZIS Toll-like receptorok mannóz-receptorok scavanger-receptorok opszonozáció: ellenanyag és komplementkomponensek jelenlétében, Fc és komplement- receptorok révén aktivált MF-ok (LPS, IFNg) MIKROBAÖLÉS intracelluláris kórokozók eliminálása ROI, RNI (NO, ONOO-) MF kétlépcsős aktivációja szükséges Griess-Ilosvay reakció: NO2- (nitrit)

A MAKROFÁGOK RECEPTORAI, SEJTFELSZÍNI MOLEKULÁI LPS receptor (CD14) + TLR4 Scavanger receptor Mannóz receptor MHCI TLR – patogén mintázatok FcRI (CD64) Ag + IgG Komplex FcRII (CD32) peroxidáz hidroláz MHCII FcRIII (CD16) LFA1 (CD11a/CD18) CR1 (CD35) CR3 (CD11b/CD18)

Makrofág Az immunkomplexek mérete és az effektor funkciók hatékonysága Nagyméretű immunkomplex A nagyméretű immunkomplex egyszerre több Fc receptorral képesek kapcsolódni, így a kölcsönhatások össz aviditása már elegendő az effektor funkciók elindításához Kisméretű immunkomplex A fagocita Fc receptorainak nem elég nagy az affinitása a magányos ellenanyag iránt Makrofág F a g o c i t a r e c e p t o r o k

Fagocitózis A mikróbák a fagociták receptoraihoz kötődnek A fagocita membrán körülöleli a mikróbát A mikróba a fagoszómába záródik A lizoszóma a fagoszómával egyesül, és a mikróba elpusztul Antitesttel opszonizált mikróba Mannóz receptor Mac-1 integrin Scavenger-receptor Fagoszóma A mikróba elpusztítása Lizoszóma

Baktériumok elpusztítása a sejtben Sejten kívüli baktériumölés Bekebelezett bak- tériumok ölése oxi-géngyökök és NO segítségével Baktériumölés a fagolizoszómákban, lizoszomális enzimekkel

Makrofág funkciók vizsgálata Antigén felvétel/fagocitózis vizsgálata: élesztők, fluorescens beadek etetése makrofágokkal, elő-opszonizált FITC jelölt E. coli fagocitózisa (FACS) NO mérés: vizeletből, szérumból (klinikum) Gries-Ilosvay (nitrit ill. nitrát visszaredukálása NO-vá), Argini –Citrulin átalakulás mérése, iNOS kimutatása (IHC, Western blot), Termelődő NO mérés DAF-fal (fluoreszcens), NO szenzor Citokin mérés: TNFa, TGFb Reaktív oxigéngyökök meghatározása: NBT teszt Hidrogén peroxid assay Citokróm c assay