IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ 9. szeminárium ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK AGGLUTINÁCIÓ, PRECIPITÁCIÓ (Az Ag-Ea kölcsönhatást követő másodlagos szerológiai reakciók)

ÁRAMLÁSI CITOMETRIA A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az immunofluoreszcenciai módszerek eszköztárába tartozik, használatuk kiegészíti egymást Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket, partikulumokat vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas (akár több millió sejt percek alatt)

AZ ÁRAMLÁSI CITOMETRIA MINT AZ IMMUNRENDSZER VIZSGÁLATÁNAK ADEKVÁT ESZKÖZE Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található, könnyen sejtszuszpenzióba vihető, fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és sejtenként vizsgálható. A nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. (pl. sejtpopulációk százalékos aránya) Kis százalékban jelenlevő sejttípusok vizsgálatára is alkalmas (pl. adott antigénre specifikus limfociták, ritka sejtpopulációk vizsgálata) Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle. (pl. sejtaktivációt kísérő változások, betegségek progressziójának nyomon követése)

CD antigén sejttípus funkció ligand CD3 T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek A CR2-vel (CD21) és a CD81 -gyel együtt a B sejt antigénreceptor koreceptor komplexe C3d, iC3b  CD21 a felismerő rész CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152

Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése PMT 1 PMT 2 PMT 4 dikroikus tükrök sávszűrők Laser áramlási cella PMT 3 minta FSC detektor fotodióda fotoelektron-sokszorozó csövek (PMT = photon multiplayer tube) Többféle fluoreszcens szín, és a megvilágító fényforrás sejteken szóródó fénye is mérhető. Fel lehet fogni fluoreszcens mikroszkópként ami alatt áramlik a minta – de nincs képalkotása, csak fényintenzitás mérés.

AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK JELLEMZÉSE SEJTFELSZÍNI ANTIGÉNEK ALAPJÁN Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van. Diagnosztikus értékű lehet: a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése Példák: gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának növekedése HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T-sejtek számának csökkenése CD4+ : CD8+ = 1.6 Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T-sejt szám <200/l (arány „átfordul”) - CD5+ B-sejtek felszaporodása – B-sejtes leukémiák egy része

Az immunválaszra gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok egy része a limfocitákat fertőzi. A HIV (Human Immunodeficiency Virus) ijesztő példája annak, hogy milyen következményekkel jár, ha az immunsejteket egy mikroorganizmus megfertőzi és elpusztítja. A HIV receptora a T-sejtek felszínén lévő CD4 molekula. A CD4 molekula a makrofág típusú sejtek felszínén is expresszálódik, így a vírus ezeket a sejteket is képes megfertőzni. A klinikai lappangás ideje hosszú, általában több év. Ezalatt mind a CD4+ sejtek, mind a vírusrészecskék gyorsan pusztulnak és újratermelődnek. Amikor a CD4+ sejtek nagyobb arányban pusztulnak el, mint ahogy a szervezet képes lenne regenerálni őket, számuk olyan alacsony értéket vesz fel, hogy a sejtközvetített immunitás működésképtelenné válik. A sejtközvetített immunválasz hiányában a gazdaszervezet halálos kimenetelű opportunista fertőzések áldozatául eshet.

A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk NK Th Tc A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T-sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk Fluoreszcens mikroszkóppal valami ilyesmit látnánk

nagy sebességű folyadékáram A CD4-FITC jelölt (TH) sejt Fókuszált lézernyaláb Th nagy sebességű folyadékáram (küvettában, vagy szabadon) CD4 FITC CD8 PE detektor A CD4-FITC jelölt (TH) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont növekvő fényintenzitás mikroszkóppal:

A CD8-PE jelölt (Tc) sejt detektor A CD8-PE jelölt (Tc) sejt detektálása CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás

A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B-sejtek) detektor A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B-sejtek) CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység növekvő fényintenzitás mikroszkóppal halványnak látszó (autofluoreszcens) sejt

kvadráns statisztika CD8 PE CD4 FITC 38% 0% 44% 18%

ÁBRÁZOLÁSMÓDOK Hisztogramm ~ 1300 dot-plot contour- plot density- Hisztogramm (Homogén sejtpopuláció hisztogrammja a normál eloszlásnak megfelelő) Az intenzitás értékek számszerűsíthetőek: ~ 1300

A KÜLÖNBÖZŐ SEJTTÍPUSOKNAK JELLEGZETES FÉNYSZÓRÁSUK VAN előre irányuló fényszórás (FSC) („méret”) oldal irányú fényszórás (SSC) (pl.granuláltság) granulociták monociták limfociták

AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE Az ismertetésre kerülő módszerek egyszerűek, olcsók, kis műszerezettségi igényűek, de többségük csak szemikvantitatív eredményekkel szolgál és bizonyos célokhoz nem kellően érzékeny

PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK Antigének vagy antitestek mennyiségi és/vagy minőségi meghatározása Szérumból, CSF-ból, vizeletből PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK

Nem azonos a precipitátummal! IMMUNKOMPLEX Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

PRECIPITÁCIÓS GÖRBE EKVIVALENCIA növekvő antigén mennyiség antigéntúlsúly ellenanyagtúlsúly sok csapadék kevés növekvő ellenanyag mennyiség EKVIVALENCIA növekvő antigén mennyiség PRECIPITÁCIÓS GÖRBE

EKVIVALENCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK - valencia (kapcsolatteremtő képesség) hőmérséklet (37оC ; 4 оC ) pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG) EKVIVALENCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK IgM-pentamer IgA-dimer Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK Immundiffúzió: immunprecipitáció lágy gélközegben radiális egyszerű (Mancini-módszer) radiális kettős (Ouchterlony-módszer) Elektroforézis: immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják) két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra elektroforetizálják) Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás-csökkenést méri) szérum- és liquorfehérjék mennyiségi meghatározása 50 µg/ml-ig Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri) szérum- és liquorfehérjék, gyógyszerszintek mennyiségi meghatározása 1 µg/ml-ig

IMMUNDIFFÚZIÓS MÓDSZEREK Mancini módszer Ouchterlony módszer Extrahálható nukleáris antigén (ENA) specifikus antitestek kimutatása (ENA: pl. Ro, La, Sm, RNP, Scl-70, Jo1) Pl. vírus antigének / vírus specifikus ellenanyagok mennyiségi meghatározása Ro La Sm Tesztelendő szérum RNP Scl-70 Jo1

ANTIGÉN KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓVAL A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Ag koncentráció Ea a gélben IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml

IMMUNELEKTROFORÉZIS + - szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása

AGGLUTINÁCIÓ

AGGLUTINÁCIÓ TÍPUSAI, GYAKORLATI ALKALMAZÁS A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé a direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén (Rh)) - főleg IgG passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók rheumatiod arthritis: A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF= rheuma faktor) jelennek meg.

- reakció gyors ülepedés + reakció lassú ülepedés

vörös-vértest DIREKT AGGLUTINÁCIÓ pl. AB0 vércsoport meghatározás

AZ ABO VÉRCSOPORTANTIGÉNEK SZERKEZETE A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják. O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN

KVANTITATÍV HEMAGGLUTINÁCIÓS TESZT Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! KVANTITATÍV HEMAGGLUTINÁCIÓS TESZT Agglutinációra képes anyagok (antitestek, vírusok) mennyiségének meghatározása antitest titer – az a legnagyobb hígítás ahol még van agglutináció

INDIREKT AGGLUTINÁCIÓ pl. Rh vércsoport meghatározás primer ellenanyag szekunder ellenanyag

A RHESUS (Rh) VÉRCSOPORTANTIGÉN (D) indirekt agglutináció IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció FEHÉRJE ANTIGÉN citoplazmamembrán extracelluláris tér intracelluláris tér

AZ AGGLUTINÁCIÓ IN VIVO KÖVETKEZMÉNYEI ABO inkompatibilitás intravaszkuláris hemolízis (komplement mediált hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (magzati vv.sejtek opszonizálása, komplement aktiváció, MF-ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését (vetélését) követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

PASSZÍV AGGLUTINÁCIÓ (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF = reuma faktor) jelennek meg. Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RF van jelen.

PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓ GÁTLÁSA OLDOTT AG-NEL Tudománytörténeti érdekesség Oldott haptén vagy Ag gátolja az agglutinációt. pl. Monoteszt terhességi teszt: vvt-k felszínéhez hCG-t kapcsolnak és hormon specifikus ellenanyaggal váltják ki az agglutinációt. Ha ehhez a rendszerhez terhes nő vizeletét adjuk (oldott hCG!), akkor gátoljuk az agglutinációt.

HEMAGGLUTINÁCIÓ ELLENANYAGOK JELENLÉTE NÉLKÜL? Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak (Nem immunológiai reakció!!!)

GYAKORLATI ALKALMAZÁS direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározás Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans indirekt agglutináció: Rh vércsoport meghatározás direkt Coombs-teszt: vércsop. inkompatibilitás, autoimmun hemolitikus anémia indirekt Coombs-teszt: transzfúzió előtt, terhességalatt passzív agglutináció: rheuma faktor kimutatása terhességi monoteszt GYAKORLATI ALKALMAZÁS