IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (PRECIPITÁCIÓ)

Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott szolubilis komplexei. IMMUNKOMPLEX Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott szolubilis komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

Precipitációs görbe ellenanyagtúlsúly EKVIVALENCIA antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

egyéb (pl. PEG) – az oldékonyságot csökkenti Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: -valencia -pH hőmérséklet (pl., hideg agglutininek /IgM antitestek/ 4 °C,és meleg agglutininek /IgG antitestek/ 37 °C által mediált autoimmun hemolítikus anémiák) sókoncentráció idő (antigén-antitest kötődés pillanat alatt, míg a precipitátumhoz több óra kell) egyéb (pl. PEG) – az oldékonyságot csökkenti IgA-dimer IgM-pentamer

MÓDSZEREK Immundiffúzió: - radiális egyszerű (Mancini) - radiális kettős (Ouchterlony) Elektroforézis: - immunoelektroforézis - rakéta elektroforézis - két-dimenziós elektroforézis - izoelektromos fókuszálás és immunofixálás Nefelometria (fény csökkenés mérése) Turbidimetria (fényszórás mérése)

IgG koncentráció mérése stérumból radiális immundiffúzióval. Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval Antigént tartalmazó lyuktól való távolság Az optimális arányt adó antigén koncentráció. IgG koncentráció mérése stérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Precipitációs gyűrű Antigén koncentráció

Ag koncentráció A precipitációs gyűrű átmérője Bakteriális extra-intracelluláris enzimek, anyagcseretermékek Pl., koaguláz termelés (S. aureus) A precipitációs gyűrű átmérője Ag koncentráció

Radiális kettős immundiffúzió

Elektroimmunodiffúzió (Laurell) „Rakéta elektroforézis” Elektroimmunodiffúzió (Laurell) A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén koncentrációjával koagulációs faktorok kimutatása (pl., vWF, trombin aktivitás)

Immunelektroforézis Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők.

Gammopátiák diagnosztikája: M komponens kimutatása zónaelektroforézis és immunoelektroforézis segítségével

Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése

Y Az in vivo képződő immunkomplexek eltávolításának mechanizmusai C1q precipitálás oldás blokkolás C1q C1r, C1s (aktív enzim) C4, C2 C3a C5,6,7,8,9 lízis gyulladás memória B-sejtek C3 C3b FcR fagocitózis citotoxicitás oldható komlexek kimutatása fizikai méret ppt (PEG, stb.) Anti-Ig Anti-C3 C1q kötés sejthez kötődés C3 receptor Fc receptor Az in vivo képződő immunkomplexek eltávolításának mechanizmusai VVT CR1 CR3 Makrofág

Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiod arthritis). A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF) jelennek meg.

- reakció - reakció + reakció gyors ülepedés lassú ülepedés

Direkt agglutináció IgM antitest pl. AB0 vércsoport meghatározás vörös-vértest

Az ABO vércsoportantigének szerkezete O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! - + + + - - + + - + - + - - - -

Vércsoport meghatározás Ágy melletti gyorsteszt Microplate-s meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Gélkártyás technika Gyorsteszt – lemezre szárított anti-A, B, D antitestekkel (agglutinációt figyelik) Csempés – tesztelendő vérhez folyékony antiszérum (agglutináció) (kétoldalas teszt , ha a beteg szzérumát is hozzáadják ismert vércsop. vérhez) mikroplét – beszárított antitestekkel (agglutináció) gélkártya – automatában használják, a hozzáadott vérből keletkező agglutinátum nem centrifugálható le a gélben

Indirekt agglutináció IgG primer ellenanyag (antitest) vörös-vértest IgG szekunderellenanyag (antitest) pl. Rh vércsoport meghatározás

FEHÉRJE ANTIGÉN A VÖRÖSVÉRTESTEKEN A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) FEHÉRJE ANTIGÉN A VÖRÖSVÉRTESTEKEN D antigén extracelluláris tér citoplazmamembrán intracelluláris tér Anti-D antitest IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

(diagnosztikai/indikátor módszer) Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF = reuma faktor) jelennek meg. Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RF van jelen.

Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? (Nem immunológiai reakció!!!) Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározás Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans indirekt agglutináció: anti-D Ea jelenlétének kimutatása direkt Coombs-teszt: vércsop. inkompatibilitás, autoimmun hemolitikus anémia indirekt Coombs-teszt: transzfúzió előtt, terhesség alatt passzív agglutináció: rheuma faktor kimutatása terhességi monoteszt Tiphoid láz: tífusz, paratífusz (Salmonellosis) Febris undulans: Brucellosis