A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát

+ V Extracelluláris Intracelluláris (0 mV) ( -70 mV) A membrántranszport alapjai Membránpotenciál - bevezetés Általában a sejtek belső tere negatívabb az extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között. V Extracelluláris Intracelluláris + (0 mV) ( -70 mV)

A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség Diffúziós potenciál Eltérő ionmobilitású anion és kation esetén. (pl. egy csepp sósav diffúziója) V + Cl- H+

ΔE 1, az oldat ionjait a koncentráció különbség mozgatja a túloldalra 2, a különböző töltéssel rendelkező ionok átlépési sebessége a szemipermeábilis hártyán keresztül különböző – az ábrán az előre siető negatív töltésű ionok a túloldalon negatív töltésű réteget hoznak létre, így átmeneti feszültség: diffúziós potenciál alakul ki 3, ez lassítja a további anion előrehaladást de gyorsítja a kationok átjutását – ez a hatás csökkenti a diffúziós potenciált 4, a végén a koncentrációk kiegyenlítődnek, és a diffúziós potenciál eltűnik

Hány darab anion átlépése kell -100 mV feszültség kialakításához egy 1 μm2-es membránon? Persze csak egy pillanatig, amíg a kation párja azonos irányban őt nem követi

V + Cl- K+ Cl- K+ Cl- K+ 100 mM KCl 10 mM KCl A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség 2. Membránpotenciál Előfeltétel: egyenlőtlen ionmegoszlás és szelektív permeabilitás A. Egyensúlyi potenciál Szelektív permeabilitású membrán (átmegy: K+, nem: Cl-) V -60 mV K+ áramlás a koncentráció- különbség miatt A kialakuló feszültség leállítja a további áramlást (egyensúly) Cl- K+ Cl- K+ + Cl- K+ 100 mM KCl 10 mM KCl

Az egyensúlyi potenciál jellemzői A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség Az egyensúlyi potenciál jellemzői Néhány ezer ion egyenlőtlen megoszlása elég a potenciálkülönbség kialakításához, az ionkoncentrációk változása elhanyagolható. Az egyensúlyi potenciál tartósan (elvileg végtelen ideig) fennállhat. Ilyenkor a koncentrációkülönbség miatt az egyik irányba ugyanannyi ion mozog, mint a potenciálkülönbség miatt a másikba. Minél nagyobb a membránon átjutó ion két oldalon található koncentrációinak hányadosa, annál nagyobb a potenciálkülönbség.

Az egyensúlyi potenciál kiszámítása Nernst egyenlet: E = ln E : membránpotenciál (volt) R: általános gázállandó ( 8.31 J/mol/K) T: abszolút hőmérséklet (K) z : töltésszám (K+-ra: pl. +1) F : Faraday-állandó ( 96500 C/mol) Gyakorlatban jól használható formája: E= log10 - RT zF cBELSŐ cKÜLSŐ cBELSŐ cKÜLSŐ - 60 mV z

- 60 mV 140 mM EK= log10  - 90 mV 4 mM +1 15 mM - 60 mV Az egyes ionok egyensúlyi potenciálja állati sejtekben fiziológiás ionmegoszlások esetén EK= log10  - 90 mV 140 mM 4 mM - 60 mV +1 ENa= log10  + 60 mV 15 mM 140 mM - 60 mV +1 ECl= log10  - 80 mV 4 mM 103 mM - 60 mV -1 ECa= log10  + 120 mV 10-7 M 10-3 M - 60 mV +2

A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség B, Donnan-potenciál Ionokra átjárható, fehérjére nem permeábilis membrán esetén jön létre A negatív töltésekkel rendelkező fehérjék oldalán nagyobb kation koncentráció és a kis molekulájú, permeábilis anion alacsonyabb koncentrációja alakul ki az ellenkező oldalhoz képest, egyensúlyi állapot formájában. -10 – -15 mV potenciálkülönbség jön létre. (A fehérjék oldala a negatívabb.) A sejt nyugalmi membránpotenciálja döntően NEM a Donnan-potenciálon alapul.

A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség C. Pumpapotenciál A H+-pumpa, és állati sejtek esetén a nátrium pumpa (Na+/K+-ATPáz) elektrogén. (3 Na+ ki, 2 K+ be) A H+-pumpa (és Na+-pumpa) folyamatos működése ezért negatívabbá teszi a sejt belsejét. Ez közvetlenül csak kb. 10-20 mV-tal járul hozzá a membrán-potenciálhoz. A Na+-pumpa azonban az egyenlőtlen külső és belső Na+ és K+ koncentrációkat biztosítja, és így közvetve a membránpotenciál fenntartásához szükséges.

+ A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet I. V Cl- K+ V -60 mV K+ egyensúlyi potenciál !! Vm = -60 mV IK=INa=0 PK>>PNa=0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl

+ A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet II. V Na+ Cl- V +60 mV Na+ egyensúlyi potenciál !! Vm = +60 mV IK=INa=0 PNa>>PK=0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl

A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet III. IK = -INa>0 Vm = 0 mV Koncentráció-kiegyenlítődés Na+ V 0 mV K+ PNa=PK>0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl

A III. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ A kifelé áramló pozitív töltések áramát tekintjük pozitívnak hagyomány szerint. (A példában IK>0) Stabil membránpotenciál esetén a membránon átfolyó összes áram összege nulla. (A példában IK+INa=0) (Egyébként valamelyik oldalon töltésfelhalmozódás lenne, és Vm változna) Ha membrán többféle ionra is permeábilis, akkor hosszú idő után a koncentrációk kiegyenlítődhetnek. (A példában mindkét oldalon [Na+] = [K+] = 55 mM értéken). In vivo ezt a Na+-pumpa akadályozza meg.

+ IV. Az állati sejtek nyugalmi membránpotenciálja V IK = -INa>0, mert egyensúly van (állandó Vm) EK < Vm << 0 Koncentráció-kiegyenlítődés Na+ V K+ + PK >>PNa>0 PCl=0 “I” “E” Vm hol van az EK, 0, ENa értékekhez képest? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl

A IV. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ Egy ‘átlagos’ nyugvó állati sejtben: - kifelé K+ áramot befolyásolja:  nagy koncentrációkülönbség  nagy K+ permeabilitás  negatív membránpotenciál - befelé Na+ áramot befolyásolja:  nagy koncentrációkülönbség  kis Na+ permeabilitás  negatív membránpotenciál Így a két áram egyenlő  stabil nyugalmi Vm

Hogy hol, az a PK és PNa arányától függ. A membrántranszport alapjai A membránpotenciál kiszámítása Vm: EK és ENa között van. Hogy hol, az a PK és PNa arányától függ. PNa<PK (nyugalmi) esetben: EK<Vm<<ENa PNa>PK esetben: EK<<Vm<ENa Képlettel: Vm= EK+ ENa+… (ahol g=1/R: vezetőképesség (Siemens)) gK gteljes gNa Vm kiszámítható (Goldman-Hodgkin-Katz, GHK) Vm = ln - RT zF PK[K+]I+PNa[Na+]I+PCl[Cl-]E PK[K+]E+PNa[Na+]E+PCl[Cl-]C

Mitől és milyen irányban változhat a membránpotenciál? Vm  : depolarizáció Vm  : hiperpolarizáció “pozitívabbá válik” “negatívabbá válik” Ionkoncentráció változás (in vivo nem jellemző) pl. [K+]E  IK, out  depol. [Na+]I   INa, in   hiperpol. Permeabilitás változás (in vivo a szab. fő útja) pl. PK  IK  hiperpol. PNa  INa  depol.

Mi biztosítja a sejtmembrán szelektív permeabilitását?  Ioncsatornák A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák Mi biztosítja a sejtmembrán szelektív permeabilitását?  Ioncsatornák Transzmembrán fehérjék, melyek hidrofil pórust képeznek ionok számára Egy ion transzportja során nincs konformációváltozás, csak nyitás  zárásnál Igen magas katalitikus szám (106-108 ion/sec) Erősen szelektívek lehetnek (1 hiba/103-104 ion) Nyitás  zárás szabályozott lehet, ez alapján csoportosíthatók: - ligandfüggő - háttér (csurgó, leak) - feszültségfüggő - mechanoszenzitív

Ionszelektivitás szerinti felosztás A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák Ionszelektivitás szerinti felosztás kationcsatornák anioncsatornák (Cl-, NO3-) Szelektív (K+, Ca2+) nem specifikus csak egyértékű (monovalens) ionokat ereszt át (Na+ és K+) kétértékű (bivalens) ionokat is átereszt (Na+, K+ és Ca2+)

A membrántranszport alapjai Kation csatornák pórus hurkokkal Egy pórus hurkokkal rendelkező K+-ioncsatorna háromdimenziós modellje oldal- és felülnézetben. A különféle ioncsatorna-féleségek alegységeinek síkban kiterített szerkezete. Pórus motívum K+ csatorna alegységek A csatorna négy alegységből szerelődik össze. Amíg egyes K+-csatornák két, vagy négy alegységből szerelődnek össze, addig a Na+- és Ca2+-csatornákat egyetlen hosszú polipeptid lánc alkotja.

K+ csatornák K+ csatornák Nátrium & Kalcium Feszültség- kapuzott KQT eag slo CNG Novel > 23 gén KVLQT KVLQT2 slo slo2/slack eag erg elk A Ca2+- és a Na+-csatornák génjei egy ősi K+-csatorna-gén ismételt duplikációja és módosulása nyomán képződtek. Az ioncsatornák génjei az evolúció során kialakult és bevált funkció megőrződéséről, variálódásáról szólnak.

Szűk nyaki rész: 1,2 nm hosszú, átmérője 0,28 nm. A csatorna átmérője szabja meg, hogy milyen ionok haladhatnak át rajta. A nyaki rész falát a pórusmotívum (signature sequence) aminosavjai burkolják. Mivel a K+-ionok hidrátburkát alkotó vízmolekulák 0,28 nm-re vannak a K+-ion középpontjától, a járat túl szűk egy K+-ion áthaladásához. A hidrátburok vízmolekuláit csak komoly energiabefektetés árán lehet eltávolítani, ám a K+-csatornák működésük során nem fogyasztanak energiát. Mégis, miként lehetséges az, hogy a nyitott K+-csatornán másodpercenként nagyjából egymillió K+-ion halad át? A szűk járat belső felszínén karbonil- (C=O) oxigén-atomok vannak. Az oxigénatomok részleges negatív töltést hordoznak, és úgy helyezkednek el, hogy a járaton áthaladó K+-ionok a hidrátburok vízmolekulái helyett az oxigénatomokkal lépjenek kölcsönhatásba. A kölcsönhatás energetikailag kedvező környezetet teremt az ionok áthaladásához.

A szelektivitási filter szerkezete: a VGYG motívum KcsA (2TM1P) csatornában A szelektivitási filter szerkezete (karbonil oxigének)

Roderick MacKinnon (47), laureate of the Nobel Prize in Chemistry 2003 K+ ionok (zöld) és víz molekulák (piros) áthaladása a póruson. „Billiárd-típusú” átjutás

A membrántranszport alapjai Kálium ionok átjutása Kv1.2 csatornán – számítógépes szimuláció

Na+ K+ A membrántranszport alapjai A szelektivitási filter szerkezete (a K+ szelektivitás mechanizmusa) A K+-nál (1,33 Å) kisebb átmérőjű Na+-ionok (0,95 Å) számára a karboniloxigén-atomok (C=O) túlságosan távol helyezkednek el, amiért nem tudnak az ionnal kölcsönhatásba lépni, ami miatt a Na+-ionok nem tudnak átjutni a K+-csatornákon. Másképpen: a Na+-ionok erősebben kötik a vizet, mint a K+-ionok, nem képesek elegendően közel menni a szűrőhöz, hogy elveszítsék a hidrátburkot. Szelektivitás: 1:1000. Na+ K+

Kapuzás a “belső szájadékban” A kapuzó hélix (H5) helyzetét a sejtmembránban az határozza meg, hogy milyen kölcsönhatás van a membrán két oldalán felhalmozódott töltések és a kapuzó hélixek töltése között. Depolarizáció során a kapuzó hélix a sejthártya külseje felé mozdul, és miközben megváltozik az ioncsatorna szerkezete, kinyílik, rajta ionok áramlanak át. Állati sejtekben az átáramló ionáram erőssége már a depolarizáció alatt csökkenni kezd, mert a csatorna inaktiválódik.

(nem vezet) Depolarizáció Repolarizáció Spontán Zárt Nyitott Inaktív A membrántranszport alapjai Az inaktiváció Állati sejtekben a feszültségfüggő Na+ csatorna inaktiválódik (akciós potenciál). Növényeknél nem jellemző a hasonló inaktiváció (pl. GORK 30 percig is aktív marad), az AP másként keletkezik. A csatornának 3 funkcionális állapota van: Zárt Depolarizáció Nyitott Spontán Repolarizáció Inaktív (nem vezet)

Az inaktiváció kísérletes kimutatása (makroszkópos áram) zárt nyitott inaktív Em INa Idő (ms)

A megnyílás és az inaktiváció is statisztikus jelenség az elemi áram szintjén Em elemi áramok több mérés során egy csatornán összegzett áram Idő (ms)

Inaktiváció “tömeszeléses” mechanizmussal: N-típusú inaktiváció Az N típusú inaktiváció esetében az ioncsatorna fehérje N-terminálisa a pórus citoplazma felőli bejáratához kötődik, bedugaszolja a csatornát

Kapuzás a szelektivitási filterben: C-típusú inaktiváció C típusú inaktivációt - nevével ellentétben - nem a fehérje C-terminálisa, hanem a szűk nyaki rész körüli fehérjerészek okozzák: az ioncsatorna a fényképezőgépek blendéjéhez hasonlatos módon záródik.

A szelektivitási szűrő K+-függő szerkezetváltozásának biológiai jelentősége. 2 1 aktivációs kapu A szűrő kálium-koncentrációtól függően zárt (low K+) és nyitott (high K+) állapotú lehet. Ha az aktivációs kapu nyílik (1), több kálium jut a szűrő közelébe, high K+ állapotú szűrő  nyitódás (2). Zárt aktivációs kapu esetén a low K+ állapot alakul ki. Ez a magyarázata a milliszekundumos nagyságrendű „pislákoló” ioncsatorna nyitódásnak-záródásnak, mely még nyitott feszültség-függő aktivációs kapu esetén is mérhető.

A membrántranszport alapjai K-csatorna inaktiváció Nyugalmi helyzet, zárt csatorna Depolarizált sejthártya, nyitott helyzet Depolarizált sejthártya, N-típusú inaktiváció Depolarizált sejthártya, C-típusú inaktiváció

A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Sejtre tapasztott (cell-attached) felállás Mekkora áramot kell átfolyatnom, hogy Vm az általam megkívánt érték legyen? Feszültség clamp Pipetta széle és a membrán között NAGY (G) ellenállású kapcsolat (seal). mért csatornák

A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Teljes sejt (whole cell) felállás Feszültség clamp mért csatornák

A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Kivágott folt (excised patch) felállás Feszültség clamp mért csatorna/csatornák (Akár egy csatorna árama is mérhető, az áram pA (10-12 A) nagyságrendű.) Nyitott Zárt

Az ioncsatornák működése: makroszkópos áram (sok ugyanolyan csatorna együttes árama) K+ szelektív pórus (PK konstans, nem függvénye Vm-nek), szimmetrikus oldatok I Feszültség-áram összefüggés C1 < C2 C2 C1 Vm (mV) Pl.: mindkét oldalon 4 mM [K+] mindkét oldalon 140 mM [K+]

K+ szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok C2 EK C1 Vm (mV) Pl.: belül C2=140, kívül C1=4 mM [K+] IK=0, ha Vm=EK

Feszültségfüggő, kifelé rektifikáló K+ csatorna (pl. GORK) PO nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) K+ áram (EK fölött IK>0) EK Vm (mV) I Feszültségfüggő csatorna K+ árama (EK és küszöb között IK=0) EK Vm (mV) küszöb  -30 mV

Befelé rektifikáló K+ csatorna (pl. KAT1) PO nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) K+ áram EK Vm (mV) EK I (nagyítva!) bef. rekt. csatorna K+ árama (EK felett: IK>0 csak egy szűk tartományban) Vm (mV)

Cl- szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok Vm (mV) ECl Pl.: belül C1=140, kívül C2=15 mM [Cl-] ICl=0, ha Vm=ECl

Feszültségfüggő Cl--csatorna nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) Cl- áram Vm (mV) ECl I Feszütségfüggő csatorna Cl- árama Vm (mV) küszöb  -75 mV ECl ECl pozitív értékű, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell

A membrántranszport alapjai 6. A növényi ioncsatornák működése PM, Anion csatornák Turgor beállításnál hipotóniás stressz esetén a sók kiáramlását szabályozza Legfőképp Cl- ionról van szó, ezek Ca2+-aktivált csatornák, 2 osztálya van: S(slow)-típusú és R(rapid)-típusú feszültségfüggő anion csatorna Szerkezetük: 13 TM szegmens R-típusú S-típusú ECl általában pozitív értéket ér el, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell 3 db fontos funkció: A csatornák nyitódása nem csak Cl- vesztést eredményez, hanem membrán depolarizációt is okoz. Ez aktiválja a kifelé egyenirányító K+-csatornákat a sók kiáramlásánál. A jelátvitel során tapasztalható membrán-depolarizációban központi jelentőségű. Erős hiperpolarizáció esetén nyitódnak (ha a befelé egyenirányító K+-csatornák működése gátolt pl. kevés külső K+ cc. esetén)