Pécsváradi Attila egyetemi docens Citokininek Pécsváradi Attila egyetemi docens

Citokininek

A citokininek felfedezése és fogalma - Haberlandt, 1913: floemnedv, sejtosztódás - van Overbeek, 1941: kókusztej - Miller, Skoog, 1954: kinetin (6-furfurilamino-purin, DNS degradációs termék) - Miller, Letham, 1961,1963: transz-zeatin, a természetes citokinin Citokinin: purinvázas, sejtosztódást indukál, kallusztenyészet növekedését fenntartja (auxinnal együtt)

A citokininek felfedezése Plate 4 from Skoog and Miller (1957) showing the effect of the auxin to cytokinin ratio on the pattern of development Amasino,R. Plant Physiol. 2005;138:1177-1184 Copyright ©2005 American Society of Plant Biologists

A citokininek felfedezése Amasino,R. Plant Physiol. 2005;138:1177-1184 Copyright ©2005 American Society of Plant Biologists

A citokininek felfedezése Amasino,R. Plant Physiol. 2005;138:1177-1184 Copyright ©2005 American Society of Plant Biologists

Természetes citokininek

Szintetikus citokininek

Természetes citokininek transz-ZEATIN

Izoprenoid citokininek X2 X3 X4 X5 Név Rövidítés H N6-(D2-izopentenil)adenin iPA R N6-(D2-izopentenil)adenozin iPAR CH3S 2-metiltio-N6-(D2-izopentenil)adenozin MTiPAR RP N6-(D2-izopentenil)adenozin-5’-monofoszfát iPARMP G N6-(D2-izopentenil)adenin-3-glükozid iPA3G N6-(D2-izopentenil)adenin-7-glükozid iPA7G N6-(D2-izopentenil)adenin-9-glükozid iPA9G X1

Izoprenoid citokininek X1 H transz-zeatin Z R transz-zeatin ribozid ZR RP transz-zeatin-ribozid-5’monofoszfát ZRMP G transz-zeatin-3-glükozid Z3G transz-zeatin-7-glükozid Z7G transz-zeatin-9-glükozid Z9G Ala lupinsav Z9Ala cisz-zeatin cis-Z cisz-zeatin-9-glükozid cis-Z9G transz cisz

Aromás citokininek X1 H N6-benziladenin BA G N6-benziladenin-3-glükozid BA3G N6-benziladenin-7-glükozid BA7G N6-benziladenin-9-glükozid BA9G Ala N6-benziladenin-9-alanin BA9Ala R N6-benziladenozin BAR

Szerkezet és funkció Hormonaktivitás csökken: - 3-as, 7-es N cseréje C-re - 8-as pozícióba N (azapurin) - 2-es, 3-as pozícióban hidroxiláció Hormonaktivitás fokozódik: - N6-nál az alkillánc hosszúsága 5 C atomig a szénlánc telítetlensége 2-es pozícióban halogén, 9-be, -CH3 2-es pozícióban -S-CH3 csoport

A szerkezet és hatás összefüggése Módosított purinvázas citokininek

Szerkezet és funkció Hormonaktivitás csökken: - 3-as, 7-es N cseréje C-re - 8-as pozícióba N (azapurin) - 2-es, 3-as pozícióban hidroxiláció Hormonaktivitás fokozódik: - N6-nál az alkillánc hosszúsága 5 C atomig - a szénlánc telítetlensége - 2-es pozícióban halogén, 9-be -CH3 - 2-es pozícióban -S-CH3 csoport

A szerkezet és hatás összefüggése Anti-citokininek (pszeudopurin váz)

A citokinin receptor

Bioszintézis 2i 2iPP 2iPP=Δ2-izopentenil pirofoszfát iPARMP= i-pentenil-adenozin-monofoszfát iPAR= izopentenil adenozin Z = zeatin DHZ = dihidrozeatin 2i 2iPP

Bioszintézis –további lehetőségek

Transzfer RNS-ben CITOKININ

Bioszintézis helye, habituáció, transzport Szintézis fő helye: gyökércsúcs Szállítás a xilémben Recirkuláció (floem) Reciklizálódás: tavasz / ősz Habituáció: kallusz kultúrák autonómmá válása

A citokinin konjugátumok típusai TÍPUS KAPCSOLÓDÁSI HELY Citokinin ribozid és -ribozid-5’-foszfát N-9 Citokinin-N-glükozid N-3, N-7, N-9 Citokinin O-glükozid O-4’ Ribozil-citokinin-glükozid N-9, O-4’ Citokinin-aminosav konjugátum N-9

Zeatin konjugátumok

A citokininek lebontása

A zeatin lebontási folyamata

A citokininek kimutatása Immunológiai módszerek ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) RIA (Radio Immuno Assay) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) GC-MS (Gas Chromatography - Mass Spectrometry) ESI (Electrospray Ionization) MECC (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) Biológiai tesztek + extrakciós technikák pl. SPE (Solid Phase Extraction)

A citokininek kimutatása

A citokininek kimutatása zeatin kinetin Citokinin koncentráció, log [M] -10 -9 -8 -7 Kallusz növekedése

A citokininek kimutatása Xanthium sziklevél teszt Növekedés, % Citokinin koncentráció [M] benziladenin zeatin kinetin adenin

A citokininek kimutatása Klorofill retenciós teszt Kinetin koncentráció Klorofill tartalom Kezdeti érték

A sejtosztódás szabályozása Hagyma gyökércsúcs sejt interfázisban -DNS replikáció a S fázisban -Állati sejtben kulcsregulációs pont a G1 -növényi sejt kiléphet a proliferációs ciklusból -két kontroll pont van a ciklusban: a DNS replikáció iniciálása és mitózis iniciálása : G1 és G2 -poliploidia: DNS replikáció mitózis és citokinézis nélkül

A sejtosztódás szabályozása citokinin Cdc25 Cdk M S R G2 G1 CycD3 ICK1 ABA Auxin Citokinin GA E2F Rb Cdc25= foszfatáz Cdk = ciklin dependens kináz CycD3 = ciklin D3 gén E2F = elongációs faktor Rb = retinoblasztóma fehérje ICK= ciklin függő kináz inhibitor

Fejlődésélettani hatások Organogenezis szabályozása Sejtmegnyúlás serkentése (sziklevelek) Serkentik a kloroplasztiszok érését (intracelluláris morfogenezis) Jelzik a növény N-ellátottságát Szabályozzák az öregedést Tápanyageloszlás (sink-source viszonyok)

Vegetatív szervek organogenezise inokulum kallusz gyökér hajtás nem növekszik IES (mg/l) Kinetin (mg/l) 3 0.03 0.2 0.02 1

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

A nitrogén ellátottság hatása

Az öregedés szabályozása Tápanyageloszlás C D kinetin fiatal öreg - Radioaktív aminosavat a jobb levélfélre helyezték ( ) - Leképezés: autoradiogram

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje

A citokinin jelátvitel modellje Citokinin receptor (AHK, CRE1) érzékeli a jelet és foszforilálja a foszfotranszfer fehérjét (AHP) A foszfo-AHP a sejtmagba jut és átadja a foszfátot a B-típusú válaszregulátornak (type-B ARR) A foszforilált B-válasz regulátor aktiválja az A típusú válaszregulátor gének (type-A ARR) transzkripcióját Az A-ARR akkumulálódik és negatív feedback révén represszálja az kört. citokinin CHASE PM Jelátvétel Foszforiláció Foszfotranszfer protein (AHP) Effektorok Válaszregulátor-A Válaszregulátor-B effektorok fény mRNS transzkripció CRE1 His kináz

A citokinin jelátvivők expressziós mintázata

Citokininek - máshol Taphrina sp. (boszorkányseprő)

Citokininek - máshol Pseudomonas savastanoi

Citokininek - máshol Rhodococcus fascians

Citokininek - máshol Stigmella aceris

Citokininek - máshol Stigmella tiliae

Citokininek - máshol Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens: tumoros növekedés

Protoplaszt-transzformációból nyert kallusz

Az A. tumefaciens által termelt opinok

Az Agrobacterium transzformáció Növényi sejt Ti-plazmid genom sebzési fenolok sejtmag vir gének indukciója kivágott egyszálú T-DNS T-DNS integráció vir fehérje vir fehérjék

Az Agrobacterium transzformáció +

A tumor indukáló Ti-plazmid T-DNS citokinin opin auxin Ti-plazmid Vir gének Ori replikációs startpont opin hasznosítás bal és jobb „border”

Agrobacterium Ti-plazmid mutánsok Részlegesen differenciálódott tumor: teratóma Auxin deficiens: „shooty” mutáns (csak hajtáskezdemények) Zeatin deficiens: „rooty mutáns (csak gyökérdifferenciálódás) (ld. előbb: vegetatív szervek organogenezise)

A Ti-plazmidból kifejlesztett bináris transzformációs vektor konstrukció hasítóhely promóter bal jobb border szelekciós marker T-DNS KÉSZ VEKTOR ÜRES VEKTOR E.coli ori A. tumef. ori

Köszönöm a figyelmet!