Antibiotikumok fejlesztése a genomika segítségével Készítette: Terecskei Kata IV.biológus

Bevezetés: 1940-1960-as évek: antibiotikumok ‘aranykora’ 1970-es évek: megnyertnek hitt csata 1985 óta: antibiotikum rezisztencia Methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) Vancomycin-rezisztens Enterococcusok (VRA) Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Multidrog rezisztens Mycobacterium tubercolosis Pseudomonasok

Genomika: új molekuláris targetek Gram-negatív baktériumok antibiotikum rezisztenciája Magyarországon 1990-es évekig gyógyszeripar célja: meglevő szerek fejlesztése (pl: tetraciklinek cglicilciklinek kinolok cfluorokinolok) Genomika: új molekuláris targetek Escherichia coli, Bacillus subtilis modellek helyett direkt a patogénnel való munka.

Genom szekvenálás: új target azonosításának alapja Szekvenálás automatizálása Első publikált megszekvenált teljes bakteriális genom: Haemophilus influenzae (1995) Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, sejtfal-szintézis c bővülhet a hatáskör Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület keresése n Ésszerűbb target-alapú stratégia Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis

Target szelektálás Kritériumok: - emberben ne forduljon elő - esszenciális legyen a baktérium növekedéséhez vagy életképességéhez - expresszálódjon a fertőzés folyamán és fontos legyen abban Target spektrum és szelektivitás: ORF azonosítás In silico vizsgálatok Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj különböző izolátumaiban) In silico vizsgálat fontossága: UDP-N-acetil-glükóz-amin enolpyruvát transzferáz (MurA)

Esszenciális génről van-e szó? met-tRNS szintetáz polipeptid deformiláz Gén-inaktiválás: - plazmid-beépítés - transzpozon-inszerciós mutagenezis - allél-replacement mutagenezis - in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása (géntermék szintjének vagy aktivitásának csökkentése) Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az antimikrobiális hatás között - nonspecifikus hatások - nem várt toxicitás

Transzkripció a fertőzés során IVET (in vivo expression technology) DFI (differential fluorescent induction) STM (signature tagged mutagenesis) microarray technika RT-PCR alapú technika

Ígéretes targetek Amino-acil tRNS szintetázok: 20 van a prokarióta sejtben c 20 új target? Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja cBactrobanTM Polipeptid deformilázok: A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-szintézisben, Pdf esszenciális a baktérium növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén esetében. Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Pdf-et gátolja több patogén baktériumban (de nem jó a farmakokinetikája) Zsírsav bioszintézis: Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több enzimmel Emlős - FAS (fatty acid synthase) komplex Kettő közt alacsony szekvencia-homológia c szelektív inhibítorok (isoniazid, thiolactomycin)

Antimikrobiális szerek fejlesztése a bakteriofágok genomjának segítségével

Staphylococcus aureus nosocomális fertőzések vancomicin, methycillin rezisztencia megszekvenált genom - esszenciális gének azonosítása - hőmérséklet-szenzitív mutánsok vizsgálata - gén inaktiválási vizsgálatok c új targetek 26 Staphylococcus aureus fág vizsgálata 31 polipeptid család -bakteriális növekedést gátolták

Bakteriofágok: - bakteriális fehérjék inaktiválása - metabolikus folyamatok gátlása 77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása c kis molekulájú inhibítorok hatása

S. aureus fág genom 150 dsDNS bakteriofág vizsgálata: Lítikus hatás 3 csoport <20 kbp (p68 fág C1) ~40 kbp (77-es fág B1/B2) >100 kbp (G1 fág A1) Funkcionális screenelés: 77-es fág - Arzenit indukálható promóter kontrollja alá helyezett fág ORF - S. aureus ars operonjáról - kis mennyiségű 77ORF104 termék esetén is gátlás - citolitikus polipeptidek (holin, amidáz) - több fág esetében is Dot screening

S. aureus DnaI 77ORF104 celluláris targetje DNS replikáció iniciációja 77ORF104-DnaI kölcsönhatás: DnaI azonosítása affinitás-kromatográfiával Far-western analízis Élesztő 2 hibrid analízis

DnaI esszenciális S. aureusban RpLLReDnaI - genetikailag módosított törzs Spac promóter RN4220 - kontroll törzs pMJ8426 plazmid - LacI-t konstitutívan expresszál

77ORF104 expresszió gátolja a DNS szintézist direkt és specifikus interakció DnaI-vel ORF67 RNS szintézist gátol

Antimikrobiális szerek hatása DnaI-re 125000 vegyület tesztelése elérhető könyvtárakból 36 hatással volt a DnaI-77ORF104 kölcsönhatásra 11 igen hatásosan gátolta a bakteriális növekedést

Összefoglalás Sok potenciális target a DNS replikációs folyamatban DnaI és DnaN Sok potenciális target a DNS replikációs folyamatban Antimikrobiális hatású fág ORF-ek azonosítása További, DnaI-hez hasonló proteinek azonosítása Screening: fág ORF-fel bakteriális target azonosítása Kis molekulájú inhibítorok További patogének vizsgálata: - Streptococcus pneumoniae - Pseudomonas aeruginosa

Köszönöm a figyelmet!