A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése Három fő csoport I típus  Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en (~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja, nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén. Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához Pl. EcoK. Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK II típus  Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében pl. EcoRI Mg2+ kell Ez a típus az elterjedt III. típus  I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától plHgaI Mg2+-t ésATP-t igényel

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Enzim Felismerőhely hossza Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Ragadós végeket adó hasítások (sticky end) 5' túlnyúló Sal I 6 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3' Streptomyces albis 3' túlnyúló Kpn I 6 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5' Klebsiela pneumonia Tompa végű hasítások (blunt end) Hae III 4 5' GG CC 3' 3' CC GG 5' Haemophilus aegyptus

Palindrom példák KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK

FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL Isoschisomers AtcI 6 5' GGTAC/C 3' KpnI 5' GGTAC/C 3'   XmaI 6 5' C/CCGGG 3' SmaI 5' CCC/GGG 3' Kompatibilis véget adó enzimek SalI 6 5' G/TCGAC 3' XhoI 5' C/TCGAG 3' FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK AflIII 6 5' A/CPuPyGT 3'   BspHI 6 5' T/CATGA 3' NcoI 6 5' C/CATGG 3' NdeI 6 5' CA/TATG 3'

DNS METILÁZOK - dam metiláz (dezoxiadenin metiláz) 5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez adenin sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén - dam- törzs használata - nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek - megoldás ugyanaz, mint a dam esetén citozin Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz

METILÁCIÓ FÜGGŐ RESTRIKCIÓS RENDSZEREK - mrr 6 metiladenin esetén - mcrA m5CG szekvencia kell - mcrB Pum5C esetén METILÁZOK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETE: DNS védelem hasítások ellen - laza specificitású helyek specificitás növelése (ha az egyik szekvencia tartalmazza a metiláz felismerő szekvenciáját (pl. HincII: GTPyPuAC, amiből GTCGAC a TaqI metiláz felismerőhelye, HincII metiláz érzékeny - metiláció függő restrikciós helyek előállítása

Polimerázok DNS függő DNS polimerázok RNS függő DNS polimerázok Templátfüggetlen DNS polimeráz DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás

DNS függő DNS polimerázok

DNS jelölés, nick transzláció

DNS jelölés, random priming N: A,C,G,T (NNNNNN) denaturálás hibridizáció DNS polimeráz dNTP polimerizáció denaturálás Jelölt szálak

DNS függő termofil DNS polimerázok

Templát független DNS polimeráz

RNS függő DNS polimeráz

DNS függő RNS polimerázok