Fonalas fágok I. M13, f1 és fd fágok, genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálnak egymással Az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS, a sejten belül: RF, replikatív forma  ez alkalmas genetikai manipulációkra A fág genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol, nagyobb intergenikus régió a VIII és a III gének illetve II és IV gének között, regulátor funkció A fág a szexpiluson keresztül fertőz, a DNS (+) szál jut be a sejtbe  ebből lesz kétszálú replikatív forma 15-20 perc, 100-200 kópia Nem öli meg a gazdasejtet, csak lassítja a növekedést VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópia, a III. számú fehérje a filament végén néhány kópiában Az RF forma képződése után transzkripció, transzláció, Replikáció: II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál WC papír modell. a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra V. fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját  kópiaszám kontroll

A fonalas fágok életciklusa

Fonalas fágok II. Fonalas fágvektorok A fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem a genom az V. fehérje a (+) szálhoz kapcsolódva vándorol a membránhoz, ott a DNS a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid fehérjékbe Nincs szoros mérethatára a pakolódásnak Fonalas fágvektorok 500 bp a II és IV gének között nem kidobható: a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját befolyásolják,  független transzkripciós terminációs szignál inszerciók befolyásolják a fág replikációt, mutációk a II és IV génben kompenzálnak LacZ  komplementáció, nincs antibiotikum minireplikon kiugrása

Egy fonalas fág térképe

Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok gVIII (vagy gIII) gén (NNN)x X : 6 vagy hosszabb

Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával Az anthrax toxin érése, patogenezise, potenciális célpontok A (PA63) heptamert felkötjük egy oszlopra

Egy példa: anthrax toxin inhibitor tervezése phage display technikával II. TYWWLD ACCTATTGGTGGCTGGAT DNS izolálás, szekvenálás (NNN)x A (PA63)7 oszlopon kromatografáljuk elúció specifikus felkötődik átfolyó

Másik példa: monoklonális ellenanyagok előállítása pIII fág display technikával Egy demonstrációs anyag a pIII alapú fág display technikára: http://www.dyax.com/discovery/phagedisplay.html

Fagemidek: fonalas fágok és plazmidok hibridjei

a középső, centrális régió eltávolítható A  fágok általános felépítése  genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS  fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság  két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak  a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb cos a középső, centrális régió eltávolítható EcoRI BamHI SalI

A lambda fág életciklusa

Lambda fág példák Helyettesítő/ replacement vektorok Inszerciós vektorok

A klónozás menete helyettesítő vektorok esetén A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

Szelekciós elvek l fágok esetén bepakolódási szabály: vad típusú l fág méretének 79-105%

Génátvitel transzdukcióval baktériumokban bakteriális DNS-t is tartalmazó többnyire defektív fágok fág DNS intakt normál fág transzdukáló fág bakteriális fágfertőzés lizogén életciklus fág genom integrálódása a baktérium kromoszómájába a fág által hordozott bakteriális DNS beépülése rekombinációval

plazmidok és l fágok hibridjei Kozmidok: plazmidok és l fágok hibridjei fertőzéssel bejuttatható plazmidok

Mesterséges kromoszómák: BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

GÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁNAK STRATÉGIÁI Gének izolálása A megfelelő organizmus génkészletéből a kívánt régiót tartalmazó szakasz valamilyen módon való kinyerése elterjedtebb, általában gyorsabb, kevesebb munkát igényel (ha lehetséges) nem feltétlenül szükséges szekvencia információ, de nem árt, ha van a különböző organizmusok genom szekvenciái nagy segítséget jelenthetnek hátrány: kodon preferencia adott, nem tervezhető Gének szintézise Szintetikus oligonukleotidokból történő összeépítés kevésbé elterjedt a gén hosszától függően sok munkát igényelhet, a fehérje elsődleges szekvenciáját ismerni kell előny: tervezhető a biológia szabályainak figyelembevételével, az optimális kodon felhasználás a gazda sejthez igazítható, az optimális fehérje túltermeltetési tapasztalatok jobban kamatoztathatók

KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI - genomiális   a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból - cDNS az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból expressziós a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns

in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA hasító helyek bal kar jobb kar centrális régió emésztés részleges vagy 20-24 kb méretű teljes emésztés fragmentek bal kar jobb kar ligálás konkatamer in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

Genomiális könyvtár készítése kozmidban SmaI c2RB 6.8 kb cos EcoRI BamHI HindIII ClaI Ampr ori Kmr Genomi DNS részleges emésztése Sau3A-val (a Sau3A kompatibilis véget ad a BamHI-gyel A 30 – 45 kb régió méret szerinti elválasztása BamHI- SmaI emésztés Ampr ori cos ligálás 30 – 45 kb-os fragmentek cos cos in vitro pakolás l fehérje extraktummal, fertőzés szelekció ampicillin rezisztens klónokra kozmid könyvtár

PARCIÁLIS GENOMI KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSE csak akkor, ha van hibridizációs próbánk Előzetes Southern M A B A+B M C D C+D Preparatív gél elektroforézis A + B vektor A B hasítás A+B-vel defoszforilálás izolálás, Southern M 1 2 3 A B 2. frakció ligálás részleges könyvtár

Southern blot és hibridizáció

Bakteriális shot-gun könyvtár készítése E. coli transzformálás elektroporálás kromoszómális DNS nebulizátor 2-3,5 kb fragmentek végek tompítása defoszforilálás összetört DNS Preparatív gél elektroforézis

A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA Cél Ismert marker 1. Ismert marker 2. 1. klón : Eco RI Bam HI Hind III Pst I Sma 2. klón 3. klón 4. klón

A KROMOSZÓMÁLIS SÉTA II

A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények  Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)    Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

A cDNS könyvtár mérete  A kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága   10000 - 30000 különböző mRNS emlős sejtekben  nagy gyakoriságú 50 - 90 %, pl. globin nem problematikus  kis gyakoriságú  0.5 % nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond   N = ln(1-P) / ln(1-1/n) N: a szükséges klónok száma a könyvtárban, P: annak a valószínûsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban, 1/n: az a mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz immunoprecipitált in vitro transzlált termék/ összes transzlált termék pl. 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N= 170000

Dúsítási eljárások Megoldás: dúsítás ( 1% alatt célszerű)  mRNS méret szerinti elválasztása - elektroforetikus úton - sucrose grádiensen minden frakciót tesztelni kell immunoprecipitációval    cDNS méret szerinti elválasztása könnyebb, ponotsabb  Poliszómák immunoprecipitációja technikailag nehéz, és csak megbízható források esetén működik

cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

cDNS-könyvtár készítése

cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer I

cDNS könyvtár készítése: Okayama-Berg módszer II

Biotinilálás

Szubsztraktív hibridizáció nem indukált minta, mRNS tisztítás indukált minta, mRNS tisztítás AAAAAAAAA 3' 5' TTTTTTTTT biotin reverz transzkripció B RnázH immobilizált streptavidin SA cDNS könyvtár csak indukált mRNS átfolyó cDNS, jelölés hibridizáció