Lézercsipesz Optika szeminárium Butykai Ádám, Orbán Ágnes 2012. április 5.

Tartalom A működés alapjai Sugároptika Maxwell-egyenetek Gyakorlati megvalósítás Alkalmazási területek Legmodernebb berendezések alapelvei Lézeres rácsok Felületi plazmonok Kitekintés

Bevezető Optikai csipesz (lézercsipesz) 1970 Arthur Ashkin1 : 10-10.000 nm (baktériumok, vírusok) csapdázása 1986 Steven Chu2 : atomok magneto-optikai csapdázása és hűtése, Nobel-díj pN nagyságrendű erők alkalmazása és mérése Elmozdulás mérése nm pontossággal Legújabb technológiák: optikai alapú sejtszétválasztás, plazmon erősítés, stb. Kép – optikai alap

Az optikai csapdázás elméleti alapjai: sugároptika (a>>λ) Optikai csapda: nagy NA lencsével lézernyaláb erősen lefókuszálva Dielektromos részecskére a fókusz közelében erő hat a beeső fotonok impulzusátadása révén n>nm eset, szórás és visszaverődés Csapdázás feltétele: max Frefraction>Freflection

Rayleigh- szórás pontszerű dipólusra (a<<λ)   A bejövő Gauss nyalábból enyhén levágják a peremet a lencse apertúrával a jobb hatékonyság érdekében. 1/e2 intenzitás (kb. 87% teljesítmény) M: relatív törésmutató, az erők előjelet váltanak, ha m<1. Gradiens erő levezetés táblánál.

A mérőberendezés felépítése Csapdázó lézer Nyalábtágító A Gauss-nyaláb dereka kitölti a mikroszkóp objektívet Irányító optika Fókusz helye és rugalmassága Pozíció- és erőmérés Manuális fókuszálás Mikroszkóp Pozíció detektor CCD kamera Dikroikus tükrök Lézerfényt visszaverik, a megvilágítást áteresztik Piezoelektromos mozgató Mintatartó mozgatása a fix csapdához képest Pozíciómérés: erő konstans. Erőmérés: csapda pozíció konstans. L3 és L4 1:1-es teleszkóp: L3 optikailag konjugált helye az objektív hátsó apertúrája. Ezért, ha L3 elmozdul, a fókusz is mozog. Távolítás-közelítés: fókuszsík mélységének változtatása.????

Csapdázó lézer Általában Gauss TEM00 módus Jó pontstabilitás, kis teljesítményingadozás Teljesítmény: kb. ~1pN/10mW csapdázásnál (mikronos beadekre) Hullámhossz Minta átlátszósága (pl. biológiai minták NIR) Abszorpció -> melegedés -> minta roncsolódása Gauss nyaláb: lehető legkisebb derék a fókuszban. Minta átlátszóság: NIR: 750-1200nm fehérjék abszorpciója és a víz abszorpciója között

Objektív NA és a transzmisszió számít Immerziós olajba merítik általában ->kicsi munkatávolság (~0.1mm) Szférikus aberrációk arányosak a törésmutató eltéréssel az olaj és a vizes csapdázó közeg között Nagy NA -> nagy intenzitásgradiens, de kisebb munkatávolság Kettős objektív elrendezés: 1:1 teleszkóp T2 transzmisszió

Pozíció detektálás Pozíció- és erőmérés kalibrációja gömb alakú mintával Többféle eljárás Videó alapú detektálás Kvadráns fotodióda Lézeres detektálás Egy vagy két lézerrel Polarizációs mérés, QPD detektoros mérés Axiális pozíció detektálása Mintán szórt lézerfény detektálása egy túltöltött fotodiódával Előreszórt és nem szóródó fotonok interferenciájával – intenzitásmérés a kondenzorlencse hátsó fókuszsíkján CCD kamerával ismert méretű minta vizsgálata Pixelméret kalibrálása távolságra ~5nm pontosság Valós idejű képfeldolgozás Mintavételezés ~15-120 Hz CMOS kamera nagy frekvencián is működik (40kHz), de a számítógép sebessége korlátozó tényező Nem megfelelő eljárás a fókuszhoz képesti relatív pozíció (erőmérés) meghatározására A csapdázott objektumot egy fotodióda kvadránsra képezik Az egyes szegmensek közti különbségi jelet mérve (teljes intenzitással normálva) a pozíció meghatározható Kis látótér, a csapda jó leképezése szükséges Nagy nagyítást igényel Lézeres detektálás: 1 lézerrel: polarizáció méréssel: beeső fény ->wollaston -> fázistolás a beaden -> wollaston egyesít -> polarizációs állapot kalibrálása : PONTOS, de csak 1D QPD detektorral: 2 lézerrel: ha több csapda van, vagy abszolút pozíciót kell mérni. Alacsony intenzitású lézer kell, dikroikus tükörrel elválasztás, vagy holografikus szűrővel

Dinamikus pozícióváltoztatás I. Dinamikus fókuszváltoztatás Brown mozgás relaxációjánál gyorsabb vezérlés kell Pásztázó tükrök 1-2kHz, 100µs válaszidő Nagy szögeltérítés lehetséges Akkusztooptikai eltérítők TeO2 kristály Akkusztikus „optikai rács” Gyors válasz (foltméret/hangsebesség) 1D eltérítés, 2 AOD: 2D Intenzitásvesztés Elektrooptikai eltérítők Feszültség -> törésmutató változás Drága Dinamikus pozícióváltoztatás: Brown mozgás relaxációs idejénél gyorsabb vezérlés kell. Tükrök: 1-2kHz, 100us válaszidő, 8urad reprodukció. Nagy szögeltérítések Akkusztooptika: TeO2 kristály: átlátszó, hanghullám->optikai rács. Gyors válasz (foltméret/hangsebesség). 1 irányú eltérítés, 2 AOD : 2D. Nagy intenzitás veszteségek Elektrooptikai eltérítők: feszültség->törésmutató változás. 1 síkon belül: törésmutató gradiens: nyaláb eltérítése. Drága. Piezzoelektromos mozgató: stabil, gyors, 3D pozícionálás. Gyors pozíció és erő kalibráció. Lehet erővisszacsatoló kört tenni bele: konstans erő: pozícionálás. Hátrány: drága, és lassú a kommunikáció.

Dinamikus pozícióváltoztatás II. Holografikus optikai csapda Több csapda egyidejű létrehozása Piezzoelektromos mozgató Mintatér mozgatása Gyors 3D pozícionálás Erő-visszacsatoló kör: konstans erő →pozícionálás

Videó detektálás CCD kamerával ismert méretű minta vizsgálata Pixelméret kalibrálása távolságra ~5nm pontosság Valós idejű képfeldolgozás Mintavételezés ~15-120 Hz CMOS kamera nagy frekvencián is működik (40kHz), de a számítógép sebessége korlátozó tényező Nem megfelelő eljárás a fókuszhoz képesti relatív pozíció (erőmérés) meghatározására

Kvadráns fotodióda A csapdázott objektumot egy kvadráns fotodiódára képezik Az egyes szegmensek közti különbségi jelet mérve (teljes intenzitással normálva) a pozíció meghatározható Kis látótér, a csapda jó leképezése szükséges Nagy nagyítást igényel

Pozíció kalibráció I. Bead kalibrált mozgatása -> detektor jelének kalibrálása Piezzo mozgatóval, rögzített beaddel Előny: teljes 3D kalibráció Hátrány: Felesleges és hosszadalmas, ha csak 1 laterális irányban alkalmazunk erőt. Nem lehet teljes rögzítést megvalósítani: sokaságátlag kell Ha csak laterális elmozdulás kell, akkor is érdemes axiális irányban is kalibrálni, mert a fókusz pontossága <~100nm

Pozíció kalibráció II. Csapdázott beaddel, a fókusz kalibrált változtatásával Fókusz kalibráció: CCD kamerával felvett csapdázott beaddel Képalkotó pozíció detektorral, vagy 2 lézerrel mérünk pozíciót Előny: Tetszőleges alakú objektumra kalibrálható és a kalibráció és a pozíciódetektálás egyazon pontban érvényes (fókusz) Detektáló lézer előnye: külön fókuszálható a csapda helyére (fókusz mögött) -érzékenyebb a pozícióváltozásra, mint a csapdázó lézer fókusza Hátrány: csak laterális irányú kalibráció (axiális merevség kisebb)

Axiális pozíciómérés és fókuszsík eltolódás Biológiai alkalmazásoknál fontos: egyik molekula a felszínhez tapadva, a másik a fókuszban -> távolság Fókusz axiális eltolódása a határfelületen való törés miatt : Snellius-Descartes és a kísérlet sem jó nagy NA lencséknél. Régen: fluoreszcencia méréssel (evaneszcens hullámmal indukált), vagy hidrodinamikai súrlódásméréssel (fal- effektus) Pozíciódetektor teljes összegjele (PSD, vagy QPD) arányos a teljes átjutó intenzitással Amikor a bead áthalad a fókuszon: 180°-os fázistolás A maximumok között elméleti illesztés A maximum jó kalibrációs pont. Innen elmozdítva a piezo mintatartót, az abszolút távolság kalibrálható. Fókuszsík eltolódás mérése: Hidrosztatikus közegellenállás Interferencia mérés Amikor a csapdázott bead a felszínhez ér, a jelük megkülönböztethetetlen lesz. A felület helye a csapdához képest ebben a pontban meghatározható. A brown mozgás ezt kicsit eltolja. Interferenciamérés: a beadről visszaverődött fény visszaverődik a felületről, és interferál az előreszórt fénnyel. A változó tag a kifejezésben a bead és a felület távolságától függ. A felület mozgatása és a fókuszpont mozgása közötti skálaparaméter a fókuszsík eltolódást jellemző f.

Erő kalibráció, merevség meghatározás   Beta: viszkózus közegellenállás, fal-effektussal korrigálva! Ismerni kell a távolságot és az átmérőt. Széles spektrum mérés kell, az aluláteresztő szűrő alulbecsli a levágási frekvenciát! Gömb alakú bead! alpha: rugóállandó Mozg egyenlet: MIÉRT EGYENSÚLY?

Erő kalibráció direkt fényintenzitás méréssel  

Alkalmazások: Transzkripció vizsgálata RNS polimeráz a DNS láncon halad végig Transzkripció: DNS szekvencia másolása, messenger RNS (mRNS) szintetizálása A DNS egyik vége a felszínhez kötve, az enzim a beadhez Polarizációs interferometrikus pozíciódetektálás A beadet a csapda fix pontján tartják → az erővektor a mérés során konst. → DNS lánc feszítése A transzkripció sebessége 25pN erőig független a feszítettségtől RNS polimeráz erős molekuláris motor A piezo mozgatásával → a transzkripció időbeli lefutása ~1 sec-os szünetek és állandó sebességű periódusok

Egymolekulás nyújtás nukleinsavakon DNS replikációnál a bázispárok olvasása → kettős spirál felbontása (dsDNS → ssDNS = helix-coil átmenet) Motiváció: DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálata Sok fehérje a DNS-hez kötődik és megváltoztatja annak stabilitását Helix-coil átmenet energiája változik (mérhető) DNS-hez kötődő gyógyszerek nyomon követése, gyógyszerfejlesztés Pl. rák elleni gyógyszerek Különböző gyógyszerek megkülönböztethetők az átmenet mérésével. 14oldalas cikkben

Nyújtási kísérlet: dsDNS nehezen nyújtható Túlnyújtás: DNS egyik vége szabadon foroghat átalakulás kb. konstans erő mellett „Erő-indukált olvadás” –modell (egyensúlyi fázisátalakulás) Nagyobb erőknél nemegyensúlyi, irreverzibilis átalakulás (függ az erő teljesítményétől is) Bezárt terület: fázisátalakulás szabadenergiájának mérése (ΔG(T)) 14oldalas

Bizonyítékok az olvadás-modellre Átalakulás közben konstans erő Az oldószer tulajdonságai erősen befolyásolják az átalakuláshoz tartozó erő nagyságát Hőmérséklet pH Extrém pH értékeknél lecsökken az olvadáspont Bázispárok olvadáspontja Poly(dG*dC)Poly(dG*dC) 30pN-al magasabb átalakulási erő, mint a Poly(dA*dT)Poly(dA*dT) Összhangban az olvadáspontokkal 14old

RNS hajtű kibontása Bázispárokkal párhuzamos irányú húzóerő (ellentétben a túlnyújtásos kísérlettel) Kb. 15 pN erő szükséges Az átalakuláshoz szükséges szabadenergia azonos Meghatározható a nyújtáshoz szükséges hossz mindkét esetben Túlnyújtás: x=0,24nm Kibontás: x=0,82nm Erők arányának becslése: 𝐹 𝑘𝑖𝑏𝑜𝑛𝑡 𝐹 𝑡ú𝑙𝑛𝑦ú𝑗𝑡 = ∆𝐺 𝑥 𝑘𝑖𝑏𝑜𝑛𝑡 ∆𝐺 𝑥 𝑡ú𝑙𝑛𝑦ú𝑗𝑡 ≈0.3 F=20pN Jó egyezés a kísérlettel Lassú húzásnál a kibomláskor és a relaxáláskor mért erő azonos volt -> reverzibilitás 14old

Források 1 Ashkin, A. (1970). "Acceleration and Trapping of Particles by Radiation Pressure". Phys. Rev. Lett. 24 (4): 156–159.