Bekő Gabriella SE, Laboratóriumi Medicina Intézet Az újabb mért és származtatott hematológiai paraméterek klinikai értéke Bekő Gabriella SE, Laboratóriumi Medicina Intézet 2013.május 30.

A hematológiai paraméterek intra-individuális biológiai variabilitása   Analyte Biological Desirable Variation specification CVw CVg I(%) B(%) TE(% B- Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4 Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 4,6 Hematocrit 2,8 6,4 1,4 4,1 Hemoglobin 6,6 B)Erythr- Mean corpuscular hemoglobin (HCM) 5,2 0,8 2,7 (B)Erythr- Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) 0,9 2,2 Mean corpuscular volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3 Platelets, count 9,1 21,9 5,9 13,4 Platelet distribution wide -- (B)Plat- Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 5,8 Neutrophyles, count 16,1 32,8 22,4 Lymphocytes, count 10,4 27,8 7,4 16,0 Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9 Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1 S- Basophile, count 28.0 54.8 14.0 15.4 38.5 A hematológiai paraméterek intra-individuális biológiai variabilitása www. Westgard.com

Az elvárt analitikai variabilitás Analyte Biological Desirable   Analyte Biological Desirable Variation specification CVw CVg I(%) B(%) TE(% B- Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4 Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 4,6 Hematocrit 2,8 6,4 1,4 4,1 Hemoglobin 6,6 B)Erythr- Mean corpuscular hemoglobin (HCM) 5,2 0,8 2,7 (B)Erythr- Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) 0,9 2,2 Mean corpuscular volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3 Platelets, count 9,1 21,9 5,9 13,4 Platelet distribution wide -- (B)Plat- Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 5,8 Neutrophyles, count 16,1 32,8 22,4 Lymphocytes, count 10,4 27,8 7,4 16,0 Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9 Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1 S- Reticulocyte, count 11.0 29.0 5.5 7.8 16.8 Az elvárt analitikai variabilitás www. Westgard.com

Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés Advia Hidrodinamikailag fókuszált sejtáramlás, megvilágító lézer fény és detektor Kis szög (2-4o) alatti fényszórás a sejt mérettel, a nagyobb szög alatti (10-15o) fényszórás a sejt tartalommal (pl. hemoglobin koncentráció, vagy sejtmag sûrûség) arányos A kis és a nagy szög alatt szórt fény intenzitásának komplex matematikai összefüggését a Mie teória írja le

Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés 7 lézer detektorral Beckman Coulter DXH-800 - Volume (térfogat) - Conductivity (vezetőképesség) - Axial light loss (AL2) - Low angle light scatter (LALS) - Median angle light scatter (MALS) - Lower median angle light scatter (LMALS) - Upper median angle light scatter (UMALS) fényáteresztő képesség (transparency) sejt komplexitás sejt granularitás, sejtmembrán felszíne

Fluoreszcens áramlásos cytometria Sysmex MAPPS (Multi Angle Polarized Scatter Separation) A fényszóródás mérése több szögből

CellDyn Saphire sejt méret sejt komplexitás sejt lebenyezettség sejt granuláltság MAPPS

Fluoreszcens festés A sejtek emelkedett nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoreszcens jel nagysága

Felhődiagram fluorescens festéssel Sysmex XN-2000 automatán Sysmex XE-2100

IG (Immature Granulocytes) Promyelocyta Promyelocyta IG Myelocyta Myelocyta Metamyelocyta Metamyelocyta

Felhődiagram peroxidáz festéssel (ADVIA 120) 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombocyták 4 Lymfocyták és basophylek 5 Large Unstained Cells (LUC) 6 Monocyták 7 Neutropylek 8 Eosinophylek Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) IG (Éretlen granulocyták) MPO index (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek) PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)

IG (Immature Granulocytes) Emelkedhet: Bakteriális infekció Akut gyulladás Tumor (csontvelő metastasis) Szövet nekrózis Akut transzplantátum rejekció Sebészeti, ortopédiai trauma Myeloproliferatív neoplasia Steroid Terhesség (harmadik trimeszter) Nagyobb jelentőségű az emelkedés (IGs>2%): idősek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekció myeloszupresszált betegek akut infekció neutropeniával járó szepsis

Felnőtt referenciatartomány (n=58) Bernard Fernandes, Yukio Hamaguchi:Automated Enumeration of Immature Granulocytes Hematopathology 2007

Éretlen granulocyták (IG%) optimalizált cutoff értéke infekció esetén Balamurugan Senthilnayagam at all.:Automated Measurement of Immature Granulocytes: Performance Characteristics and Utility in Routine Clinical Practice - Pathology Research International 2012

Infekcióban szenvedő betegek fehérvérsejt és IG értékei szignifikánsan magasabbak pozitív hemokultúra esetén v Balamurugan Senthilnayagam at all.:Automated Measurement of Immature Granulocytes: Performance Characteristics and Utility in Routine Clinical Practice - Pathology Research International 2012

IG % alakulása különböző betegcsoportokban (Sysmex XN1000) Egészséges kontrol Akut coronaria szindróma Szepszis gyanú N=45 N=80 N=48 NS   Egészséges IG% ACS IG% Szepszis gyanus IG% átlag 0,33 0,45 2,60 szórás 0,16 0,18 4,00

Az éretlen neutrofil granulocyták abszolút számának (#IG) alakulása különböző betegcsoportokban NS Egészséges kontrol Akut coronaria szindróma Szepszis gyanú   Egészséges #IG ACS #IG Szepszis gyanus #IG átlag 0,031 0,036 2,60 szórás 0,028 4,00

Immature Granulocytes D. P.né 81 éves, vastagbél rezekciót követően egy hónappal subileusos tünetek jelentkeznek, beteg belázasodik IG=2,8% IG=4,7% IG=24,4% IG% Immature Granulocytes

A blast flag klinikai értéke 4 különböző hematológia automatán mérve (n = 430) S.-H. KANG at al: Comparison of four hematology analyzers, CELL-DYN Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, and Sysmex XE-2100, in terms of clinical usefulness INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY 2008

Felhődiagram a bazofil csatornán (ADVIA) 1. Zaj 2. Blasztok sejtmagja 3. Monociták és limfociták sejtmagja 4. Bazofil sejtek 5. Bazofil gyanús sejtek 6. Szaturáció 7. Neutrofil és eosinofil sejtmagok Morfológiai flag-ek: BLASTS (Blasztok) LS (Nem szegmentált granulocyták)

Blasztok és abnormál lymphocyták elkülönítése a WPC csatornán (SYSMEX XN-1000)

45 leukémiás beteg „blaszt” értékeinek összehasonlítása Khí-négyzet próbával BLASTM → blaszt pozitivitás mikroszkóppal BLASTA → blaszt pozitivitás Advia2120 BLASTXN → blaszt pozitivitás Sysmex XN BLASTZ → blaszt pozitivitás Celldyn Saphire Kappa: 0,4-0,8 között→ jó megfelelőség Kappa: 0,8 fölött → kiváló megfelelőség

Az „ atyp flag „klinikai értéke 4 különböző hematológia automatán mérve (n = 430) S.-H. KANG at al: Comparison of four hematology analyzers, CELL-DYN Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, and Sysmex XE-2100, in terms of clinical usefulness INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY HEMATOLOGY 2008

45 leukémiás beteg „Atyp” értékeinek összehasonlítása (Advia, Sysmex XN, CellDyn Saphire) Khí-négyzet próbával Kappa: 0,4-0,8 között→ jó megfelelőség Kappa: 0,8 fölött → kiváló megfelelőség ATYP A → ATIP Ly pozitivitás Advia2120 ATYP XN → ATIP Ly pozitivitás Sysmex XN ATYP Z → ATIP Ly pozitivitás Celldyn Saphire

Különböző érettségű erythroblastok

Magvas vörösvérsejtek az Advia 2120 automata esetén

UniCel DxH 800 Coulter NRBC mérés: Vérminta hígítás Nem magvas vvt lizálás Elkülönítve marad: - fehérvérsejt + magvas vvs - thrombocyta - sejttörmelék Minta a flowcell-be kerül Lézer analízis - sejtméret - sejt karakterisztika - sejtmag differenciálás AL2 fénynyalábbal interferencia kiszűrése

Magvas vörösvérsejtek a Sysmex XN-1000 WNR csatornáján

NRBC mérés CellDyn-Sapphire automatán Az FL3 (speciális DNS festékanyag) 630 nm középhullámhosszú vörös fluoreszcencia -NRBC-k azonosítására alkalmas

Leletkiadás magvas vörösvérsejt esetén

A magvas vörösvérsejtek megjelenése a periférián Újszülött korban: - újszülöttkori hemolitikus betegség - koraszülöttek és újszülöttek hypoxiás károsodása Felnőttkorban: - thalassemia - myeloproliferatív neoplasia ( myelofibrosis) - szolid tumor csontvelői metasztázissal - extramedulláris hematopoiesis - hematopoietikus stressz ( szeptikémia, masszív hemorrhagia, súlyos hypoxia) Clin Chem Lab Med 2012;50(2):357–360

NRBC előfordulása hematológiai betegségekben Clin Chem Lab Med 2012;50(2):357–360

Ajánlott klinikai alkalmazás hematológiai betegségek diagnózisa súlyos kardio-thorakális műtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellátást igénylő nem hematológiai betegségben prognosztikai faktor - csontvelő transzplantáció után ( >0,2x 109/L fölött magas mortalitási ráta) - thalasszémia szindromában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozása

Reticulocyta cytogram - reticulocyta érés Advia High Angle (5-15 degrees) Oxazine 750 Absorbance

Reticulocyta mérés Beckman Coulter UniCel DxH 800 automatán Metilénkék festést használva

Reticulocyta mérés a Sysmex XN automatán

Reticulocyta cytogram Sysmex XN-2000 automatán

Reticulocyta mérés CellDyn- Saphire automatán A készülék a FL1 RNA és 7o Light scatter-t használja A ”retic-box” - ot egy hisztogramba transzformálja Egy dinamikus küszöb felállításával választja el az RBC és a RETC populációt. Második lépésben, újabb küszöb felállításával választja el az érett és az éretlen reticulocytákat (IRF) WBC Put science on your side.

Advia 2120, Beckman DXH 800. Sysmex XN-1000, CellDYN Saphire Reticulocyta % összehasonlítása 110 hemodializált beteg esetén NS P < 0,001

Advia 2120, Beckman DXH 800, Sysmex XN-1000, CellDyn- Saphire Reticulocyta % összehasonlítása NS Advia DxH800 Sapphire Sysmex

Származtatott reticulocyta paraméterek MCVr  (vagy MRV)a reticulocyta populáció átlagos sejtmérete CHr  vagy RetHe a reticulocyta populációban egy sejt átlagos hemoglobin tartalma CHCMr a reticulocyta populáció átlagos hemoglobin tartalma M-RTC% a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban M-RTC# a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben H-RTC% a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban H-RTC# a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben IRF-M+H a közepes és nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban

CHr vagy Ret-He klinikai jelentősége A reticulocyta hemoglobin content (CHr vagy Ret-He) → jelzi a vörösvérsejtek termelődéséhez, a megelőző 3- 4 napban funkcionálisan rendelkezésre álló vaskészletet Klinikai jelentősége: Vashiányos anémia diagnózisa felnőttekben(Mast et al., Blood 2002;99:1489–1491) és gyermekekben(Brugnara et al., JAMA 1999;281:2225–2230; Ullrich et al., JAMA 2005;294:924–930; Bakr and Sarette, Eur J Pediatr 2006;165:442–445). Intravénás és orális vasterápia hatékonyságát már 2-3 nap múlva jelzi (Brugnara et al., Blood 1994;83:3100–3101). Korai indikátor az erithropoein terápia monitorozásakor(Fishbane et al., Kidney Int 1997;52:217–222; Fishbane et al., Kidney Int 2001;60:2406–2411; Mittman et al., Am J Kidney Dis 1997;30:912–922; Tsuchiya et al., Clin Nephrol 2003;59:115–123; Chuang et al., Nephrol Dial Transplant 2003;18:370–377). Vashiányos anémia elkülönítése más anémiáktól Reticulocyte hemoglobin content is a recent addition to an expanding list of biomarkers that can be used to differentiate iron deficiency from other causes of anemia. Am. J. Hematol., 2008.

R= 0.93

RSf→Red blood cell size factor

IRF(Immature reticulocyte fraction) használata Anémiák differenciálása Táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiájának monitorozása Csontvelő regeneráció korai monitorozás (csontvelő transzplantáció vagy kemoterápia után) Aplasztikus anémia verifikálása Csontvelő sejtek gyűjtésének időzítése

R=0.77

R=0.85

R= 0,42

RBC fragmentocyták a Sysmex XE 2000 felhődiagramon

Fragmentált vörösvérsejtek Sysmex XE 2000 automatán Klinikai alkalmazás: Microangiopathiák diagnózisa és Monitorozása a, DIC b, thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) c, hemolytic-uremic syndrome (HUS) Thrombotic microangiopathic anemia (TMA) Csontvelőtranszplantáció utáni monitorozás HELLP syndrome Vvt-k fizikai ártalma kóros felszínen (műbillentyű, artériás graft)

Thrombocyta cytogram (Advia 120) 1 Thrombocyták 2 Nagy thrombocyák 3 Vörösvérsejtek 4 Vvs fragmentumok 5 Üres vvs-ek 1 2 3 4 5 Térfogat Refraktív index (Thr törésmutató)

Fragmentált vörösvérsejtek (schistocyták) mérésének összehasonlítása Advia 120 automatán és manuális módszerrel Lesesve JF, Salignac S, Alla F, et al. Comparative evaluation of schistocyte counting by an automated methodand by microscopic determination. Am J Clin Pathol.2007;121:739-745.

On the basis of the published scientific studies and personal experience of the Group members and expert reviewers, the ICSH Schistocyte Working Group recognizes the utility of the automated FRC count as a screening method in the routine laboratory. All samples with a positive automated FRC count at diagnosis as well as macrocytic samples with a negative automated FRC count need to be confirmed by microscopy. One major advantage of the automated FRC count is the possibility of easily obtaining an accurate and precise follow-up of true-positive samples. G. ZINI1, G. d’ONOFRIO2, C. BRIGGS3, W. ERBER4, J. M. JOU5, S. H. LEE6, S.McFADDEN7, J. L. VIVES-CORRONS5, N. YUTAKA8, J. F. LESESVE ICSH recommendations for identification, diagnostic value, and quantitation of schistocytes International Journal of Laboratory Hematology Volume 34, Issue 2, pages 107–116, April 2012 ICSH =International council for standardization in haematology

Thrombocyták Flow-cytometriás analízise High angle detector (5o - 15o) Low angle detector (2o-3o) 670nm Laser Diode High angle detector (5o - 15o) Low angle detector (2o-3o) 670nm Laser Diode As cells move through the flow cell light scatter rays appear. The detectors intercept the light and translate it into a scatter plot with each event (cell) positioned in the scatter plot according to its volume and hemoglobin concentration Előny: specificitás↑ és szenzitivitás↑

Thrombocytopenia Impedanciával mérve

Thrombocytopenia Optikai mérés a reticulocyta csatornán

Óriás thrombocyták jelenléte

Thrombocyta mérés Fluorocell fluoreszcens festéssel Sysmex XN2000 automatával Reproducibility At a level of 20x109/LPLTs, reproducibility for PLT-I, PLT-O and PLT-F on the XN2000 demonstrated coefficients of variation of 9.3%, 8.5% and 3.0% respectively. M. Schoorl Haematology & Immunology 2012

Thrombocytákról kapott információk PLT Thrombocyta szám (PLT Count x RBC Cal Factor x PLT Cal Factor) MPV Átlagos thrombocyta térfogat PDW Thrombocyta eloszlási görbe szélesség Large LPLT nagy thrombocyta térfogat (nagyobb mint 20 fl) IPF% (Immature platelet Fraction) reticulált thrombocyták

MPV signifikánsan nagyobb akut koronária betegségben MPV M A: Acute coronary events C: Controls J Clin Pathol. 2009

Átlagos thrombocyta térfogat (MPV) alakulása különböző betegcsoportokban MPV fl P<0,01 P<0,01 N=40 N=110 N=80 N=46 ACS Szepszis gyanú Kontrol Hemodializált

IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták Sysmex XE-5000 Sysmex XN 2000 IPF

Éretlen thrombocyta frakció (IPF)alakulása különböző betegcsoportokban Kontrol Hemodializált ACS Szepszis gyanú

Retikulált thrombocyta Fiatal, mRNS tartalmú thrombocyta Élettartam: 1 nap Referencia tartomány: 1.1-6.1% Érett thrombocytánál nagyobb Denzitása is nagyobb, mint az érettebb alakoké Emelkedett vagy normál IPF: ITP Alacsony IPF: CsV elégtelenség J.Lab.Med. 2008

IPF értékek különböző klinikai állapotokban: Kemoterápia utáni thrombopoesis megítélése IPF% korábban emelkedik, mint a thrombocyta szám 2. Thrombocyta transzfúzió után: IPF% 24 órán keresztül csökken ok: hígulás, TPO gátlás 3. Sepsisben az IPF% emelkedett thrombocyta szám emelkedés nélkül ok: IL-6→ TPO-szerű aktivitás perifériás thrombocyta destrukció 4. Súlyos thrombocytopéniában emelkedett IPF% esetén, a thrombocytaszám emelkedés 24-48 óra múlva várható

Köszönöm a megtisztelő figyelmet! fragmentocyta IG% IRF #IG CHr v.RetHe NRBC IPF MPV