Portoktenyésztés = in vitro androgenezis

In vitro technikák Mikroszaporítás: szomatikus sejteket tartalmazó szövetekből indul ki Diploid technika: embrió kultúra Haploid technika: androgenezis mikrospóra tenyésztés ginogenezis: ovárium (magház kultúra) ovolum (magkezdemény kultúra)

Haploid szövettenyésztési technika. Lényege: A fejlődés megfelelő stádiumában lévő pollent tartalmazó portokok kipreparálása és a benne fejlődő mikrospórából androgenezis indukciója steril, mesterséges körülmények között. Az egyedfejlődés gametofitonról sporofitonra lehet átállítani megtermékenyítés nélkül, mesterségesen.

Cél Haploid egyedek előállítása, amelyek kromoszómaszerelvénye spontán duplikációval, vagy mesterséges indukcióval megduplázódhat, így homozigóta dihaploid egyedek jönnek létre. In vivo fejlődési útról teljesen új sporofita útra történő átirányítás

Jelentősége * Irányított keresztezésekhez szükséges tiszta vonalak kialakítása, fenntartása *Recesszív tulajdonságok fenotípusos megjelenítése * Gametoklonális változás nyomonkövetése ill. felhasználása nemesítésre * Idegentermékenyülő növények beltenyésztési ideje csökken * GM növényeknél a génre nézve homozigóták létrehozása * A különböző faj- és nemzetségkeresztezésekben a haploidia lehetővé teszi hibridek előállítását (pl. Triticale ) * Az öntermékenyülő fajok F1 és F2 növényei, vagy F6, F7 nemzedékben még hasadó vonalai, törzsei egy generáció alatt rögzíthetők * Genetikaliag tiszta vonalak molekuláris markerezéshez, géntérképezéshez

Története 1930-as években első portoktenyésztéssel kapcsolatos kutatások: mikrosporogenezis és gametogenezis vizsgálata 1952: La Rue nyitvatermő pollenjének szövetszerveződésének bemutatása 1956-66: Guha és Maheshwari: Datura innoxia pollenjéből nagy számú pollenhaploidot nevelt portokkultúrában. 60-as végétől Nitsch, Niizeki és Oono pollen haploid előállítása Nicotiana, Oryza fajokból Napjainkban 80 nemzetség kb. 300 fajánál sikerült pollen haploidot előállítani

Mikrogametogenezis Sporofita életszakasz vége Ideális állapot, elvileg totipotensek!!! Sporofita életszakasz vége Pollendimorfizmus elmélete: az izolált portokban kétféle pollen van Androgén (P) pollen Kevés citoplazma Kevés keményítő

Sikeres androgenezis feltétele Nem determinált, androgén mikrospóra Ontogenezis indukálása valamilyen stresszel (hő, éheztetés, 2,4D) Sejtciklus megfelelő fázisában lévő mikrospóra (G2)

Androgenezis útja Soksejtes pollen kialakulása: Ontogenezis indukálása stressz hatására mikrospórákból Sporofita osztódások Közvetlen embriogenezis, vagy kalluszon át embriogenezis/ organogenezis Soksejtes pollen Pollen H/DH Soksejtes pollen kialakulása: *A típus: aszimmetrikus mitózis: nagy vegetatív sejt, ez tovább osztódik, a kicsi generatív degenerálódik *B típus: szimmetrikus mitózis: 2 hasonló diffúz sejtmag: belőle haploid sporofiták fejlődése C típus: szimmetrikus mitózis után a két sejtmag fúzionál: dihaploid (DH) növény fejlődése

Androgenezis módszere Donor növények nevelése Tenyésztési feltételek: Reszponzív vonalak szelektálása Virágzás eleji androgénebb pollen N hiány Alacsony hőmérséklet

2. Portok preparálás

3. Androgenezis indukció. 1/2 MS táptalaj 3. Androgenezis indukció *1/2 MS táptalaj *Vas fontos, ezért Fe-EDTA kiegészítés * Stressz indukció: magas 2,4D vagy magas NaCl

4. Inkubáció Inkubáció előtt a steril táptalajra rakott portokok hideg kezelése rövidebb- hosszabb ideig Kallusz vagy embrió megjelenésig sötét, 25-30Co Regeneráció: 3000-10000lux

5. A regenerálódott növények ploid szintjének vizsgálata flow cytométerrel történt.

6. Doubled haploid (DH) növények előállítása * Spontán rediploidizáció * Kolhicin kezelés táptalajba vagy a regenerálódott növény kolhicin oldatos kezelése

Izolált mikrospóra tenyésztés Előnyei: Portoktenyészeteknél regenerált növények eredete kérdéses Mikrospórák közvetlenül érintkeznek a táptalajjal, biológiai szűrő kiesik.

Mikrospóra izoláció módszere Egysejtmagvas és korai kétsejtmagvas pollenek izolálása virágok feldarabolásával Homogenizálni robotgéppel spec. oldatban (pl. 0,3M mannitol) Szűrés nylon szűrőn Táptalajok azonosak a portoktenyésztéssel