Aceton, butanol 2,3-butándiol Biotechnológia 1 Aceton, butanol 2,3-butándiol

AB termelés EtOH után a 2. legfontosabb fermentációs termék Pasteur (1861): mikrobiális butanol fermentáció 1900- szintetikus gumigyártás alapanyaga Clostridium acetobutylicum (1910-) Weizmann vs. Fernbach I. világháború UK: füstmentes lőporhoz aceton kellett Churchill felkéri Weizmann-t ipari termelésre Kukorica keményítőből, de UK-ban kevés volt Termelés Kanadában , USA-ban

AB termelés Háború után aceton igény csökkent Autóipar fejlődik Festék és lakkiparnak butanol kell 1925: 100 tonna butanol/nap 1930: világ első szabadalmi pere Melléktermékek hasznosítása Aceton, i-propanol, H2 + CO2 Keményítő helyett melasz Gazdaságosság megnőtt

AB termelés II. Világháború: aceton igény ismét nőtt Háború után Folyamatos fermentáció Folyamatos desztilláció Melasz alapanyag: USA Szovjetúnió, Japán is termel oldószert Háború után Olajipar fejlődik, olcsó oldószert gyárt Melaszt állati takarmányként dotálva hasznosítják Weizmann: Izrael első államelnöke Ma: ismét igény van a fermentációs iparra Megújuló üzemanyag

AB termelés Clostridium acetobutylicum Gram + Obligát anaerob Spórát képez Keményítő hidrolizátumon, melaszon jól nő csicsóka, tejpermeátum, almalé, alga is jó táp Butanol:Aceton:EtOH = 6:3:1 arányban Frakcionált desztilláció Szakaszos, folyamatos üzemmódban

AB biokémia C. acetobutylicum Szerves oldószerek Szerves savak butanol, aceton etanol, i-propanol Szerves savak ecetsav, tejsav vajsav

AB biokémia: Embden-Meyerhof

AB biokémia Acetogenezis Szolventogenezis

AB szabályzás Intracelluláris redox egyensúly szabályoz Nehéz befolyásolni pH kritikus pH ≈ 6-7 → acetogenezis pH ≤ 4 → bespórázik

AB szabályzás Intracelluláris redox egyensúly szabályoz Fe limitáció Acetogenezis utat Fe hiány gátolja Piruvát ferredoxin oxidoreduktáz (PFOR) NADH ferredoxin oxidoreduktáz [FeFe] hidrogenáz Szubsztrát limitáció Stacioner fázisban szerves savakat újra felhasználja → szolventogenezis

AB fejlesztés GMO Clostridia Immobilizáció Melléktermék hasznosítás Cellulóz hasznosítás Oldószer tolerancia Immobilizáció Folyamatos fermentáció Folyamatos oldószer kivonás Melléktermék hasznosítás Biomassza: B-vitaminok H2, CO2: energia, vegyipar

AB hasznosítás Oldószer, vegyipari alapanyag Melléktermékek Biomassza: B-vitaminok H2, CO2: energia, vegyipar Bioüzemanyag Jobb, mint EtOH bekeverés

2,3-butándiol XIX. század óta ismert fermentáció II. világháború Butadién – műgumi alapanyag Kőolajból vegyipari szintézissel Háború után Verseny a kőolajiparral

2,3-butándiol Optikai izomerek Gyógyszeripari alapanyagok

2,3-butándiol biokémia Kevert savas fermentáció Butándiol mellett acetát, etanol, stb.

2,3-butándiol biokémia Kevert savas fermentáció Diacetil = vaj íze = mesterséges vaj

2,3-butándiol termeltetés Acetát szint szabályoz Több gátló, indukáló és aktiváló hatás Nehezen kontrollálható

2,3-butándiol termeltetés Enterobacter cloaceae Fakultatív anaerob, Gram - Sok O2 → sok ATP = biomassza termelés Kevés O2 → kevert termékek DOT ≤ 3% 2,3-butándiol a fő termék

2,3-butándiol termeltetés Enterobacter cloaceae

2,3-butándiol termeltetés E. cloaceae Fakultatív anaerob Sok O2 → sok ATP = biomassza termelés Kevés O2 → kevert termékek DOT ≤ 0,3% → 2,3-butándiol a fő termék

2,3-butándiol termeltetés Alapanyag Melasz, tejpermeátum, keményítő vagy cellulóz hidrolizátum 30 – 37 °C pH = 5,0 - 5,8 mikroaerofil (!)

2,3-butándiol termeltetés Kinyerés Oldószeres extrakció nehézkes, drága Vákuum desztilláció (Fp = 180 °C) drága, sok veszteség Vízelvonással: metil-etil-keton (Fp = 80 °C) műgumi alapanyag

2,3-butándiol hasznosítás Üzemanyag adalékként Környezetbarát, de vizet jól köt Fűtőanyag Vegyipar Oldószer Műgumi metil-etil-keton → 1,3-butadién

Szerves savak: citromsav, glükonsav, ecetsav Polihidroxi-alkánsavak Biotechnológia 1 Szerves savak: citromsav, glükonsav, ecetsav Polihidroxi-alkánsavak

Citromsav Élelmiszeripar 1910-ig főleg citromból 30-40 t citrom → 1 t citromsav = 3 ha Currie: Aspergillus niger pH ≤ 2,5 → ≥ 60% konverzió Feltételek: Alacsony pH Alacsony [Mn2+] Sok cukor Alacsony növekedési sebesség 1930- világ citromsav termelés 90-95% gombával A. niger, Penicillium glaucum

Citromsav – Aspergillus niger Eukaryota Aerob glikolízis Citrát ciklus Fonalas gomba Fekete micélium Spóra Jól tárolható Tanninon szelektíven nevelhető

Citrát ciklus Cukorból acetil-CoA Acetil-CoA megy a ciklusba Szent-Györgyi - Krebs Nem keletkezik ATP, csak 2 CO2, 1 GTP és 8 e-

Citrát ciklus

Acetil-CoA Piruvát → Acetil-CoA lépés irreverzibilis

Kapcsolódás a sejtlégzéshez 8 energiadús elektron a cukorból elektronok O2-t redukálnak proton gradienst hozva létre proton gradiensből ATP

Kapcsolódás a sejtlégzéshez Citrát kör + oxidatív foszforiláció adja az eukarióta sejtek energiájának 95%-át A két folyamat számára külön sejtszervecske alakult ki: mitokondrium

Kapcsolódás a sejtlégzéshez Piruvát oxidatív dekarboxilezése és citrát kör (valamint zsírsav oxidáció) Oxidatív foszforiláció Átjárható Mátrix Belső mitokondrium membrán Külső

Citromsav biokémia Citrát ciklus csak a citromsavig megy el alacsony pH-n.

Citromsav termelés Fémhiányos környezetben Alacsony pH a fém mobilizálásnak kedvez Citromsav kelátorként fém felvételt segíti Termeléshez a cukrot felveszi, citromsavat kiválasztja, fém-citrátot felveszi

Citromsav termelés Általános feltételek Tápanyag Oxigén ellátás Melasz Szukróz (glükóz-fruktóz diszacharid) Invertáz enzim monoszacharidokra bontja Keményítő hidrolizátum Maltóz (glükóz-glükóz diszacharid) Oxigén ellátás Felületi fermentáció agar tálcákon

Citromsav termelés Specifikus feltételek pH ≤ 2,5 Fémion (Mn2+) koncentráció alacsony Kelátorok Na2-EDTA K4[Fe(CN)6] – hexaciano ferrát Kétfázisú fermentáció Micelium tenyésztés Lassú szaporodás mellett biokonverzió

Citromsav termelés Szilárd fázison fermentáció

Citromsav termelés Agar lemezbe Levegő áramoltatás Melasz K-hexaciano-ferrát Puffer mentes Levegő áramoltatás Vízgőzzel telített

Citromsav termelés Spórából indul Kétfázisú fermentáció biomassza termék Termelés végén citromsav az agarban

Citromsav kinyerés Agarból vízzel kimossák Koncentrálás Nagy térfogatban Citromsav + minden vízoldékony Koncentrálás Ca(OH)2 (Ca)3-citrát kicsapódik Szűrés

Citromsav kinyerés (Ca)3-citrát oldás Ioncserélő kromatográfia H2SO4 – erős sav Citromsav + CaSO4 Ioncserélő kromatográfia Kristályosítás

Citromsav felhasználás Ma: 700 000 tonna/év Élelmiszeripar tartósítószer üditő italok GRAS Kozmetikai ipar Kelátor Vízlágyító pl. Calgon fémtisztító Biopolimerek citrát-laktát polimerek Biofilterek pl. SO2 emisszió

Glükonsav Aspergillus niger Neutrális pH Fémion (Mn2+) kell

Glükonsav biokémia Aspergillus niger Glükóz oxidáz Kataláz Extracelluláris enzim FAD-ot tartalmaz Redox folyamat Kataláz Kapcsolt reakció H2O2 védekezésre jó Lignin degradáció

Glükonsav biokémia Aspergillus niger Glükóz oxidáz Extracelluláris enzim FAD-ot tartalmaz Redox folyamatok pH=3 alatt inaktiválódik

Glükonsav termelés A. niger Általános feltételek Specifikus feltételek sok cukor aerob 35-37 °C alacsony P és/vagy S Specifikus feltételek pH> 5 min. 10 mM Mn2+ Extracelluláris reakció Termék az agarban

Glükonsav kinyerés Oldás vízben Ca(OH)2 kicsapás H2SO4 leszorítás Hagyományos tisztítás ld. Citromsav

Glükonsav felhasználás 60 000 tonna/év Tisztítószerek vízlágyítók Kelátoló szerek Nehézfém ionokat megköti Táp vagy élelmiszer adalék pl. tofu Bioszenzor Glükóz oxidáz

Ecetsav termelés Aerob – Acetobacter sp. Alkohol oxidáció kevert ecetsav baktérium kultúra Alkohol oxidáció Alkohol dehidrogenáz Aldehid dehidrogenáz Oxigén limitált Immobilizálás pl. forgácson Biofilm = nagy felület

Ecetsav termelés Szubsztát és termékgátlás 10-15% alkoholból 10-15% ecetsav ≈ 100% konverziós hatásfok bor vs. tömény italok Félfolyamatos vagy kétlépéses eljárások

Ecetsav hatásfok növelés Immobilizálás bezárással pl. alginát, karrageán, porózus kerámia Gradiensek térben

Ecetsav Anaerob – Clostridium thermoaceticum glükóz → ecetsav Savstressz ellen pH kontroll pH ≈ 7,0 20-25% acetát koncentráció Ipari célra

Ecetsav kinyerés Élelmiszeripar Vegyipar 10-15% ecet Kombinált eljárások

Ecetsav felhasználás 200 000 tonna/év Élelmiszeripar Legrégebben használt tartósítószer Specialitás: kombucha Savanyított zöldségek

Ecetsav felhasználás Élelmiszeripar Legrégebben használt tartósítószer Specialitás: rizsecet

Ecetsav felhasználás Vegyipar Ca-Mg-acetát = “zöld só” -15 °C-ig használható Talajbaktériumok lebontják Nem korrodeál

Polihidroxi-alkánsavak 3-OH-vajsav OH-alkánsavak Prokarióta tartalék tápanyag Metanogének és tejsav baktériumok nem termelik Ralstonia eutropha aerob, könnyen tenyészthető, toxint nem termel

Polihidroxi-alkánsavak

Polihidroxi-alkánsav: bioszintézis PHA szintáz CoA-aktivált OH-alkánsav Konzervált –SH Láncnövekedés átészterezéssel Lánchossz fajtól függ Hidrofób polimer kicsapódik Ca-PHA granulum a sejtben

Polihidroxi-alkánsav: bioszintézis

Polihidroxi-alkánsav: bioszintézis PHA szintáz CoA-aktivált OH-alkánsav Konzervált –SH Láncnövekedés átészterezéssel Lánchossz fajtól függ Hidrofób polimer kicsapódik Ca-PHA granulum a sejtben

Polihidroxi-alkánsav: indukció Táplálék felesleg Fontos elem limitáció P – nukleinsav szintézis S – fehérje szintézis Nem tud szaporodni Tartalék tápanyagot halmoz fel

Polihidroxi-alkánsav: in vivo Tartalék tápanyag Ozmotikusan inert a sejtben Nem toxikus Intracellulárisan jól megőrződik Nitrogenázt védi 02 ellen

Polihidroxi-alkánsav: granula Ca-só, vízben nem oldódik PHA PHA szintáz PHA depolimeráz Strukturális fehérjék

Polihidroxi-alkánsav: tulajdonságok PHA termoplasztikus elasztoplasztikus vízben nem oldódik biokompatibilis biológiailag lebontható optikailag aktív piezoelektromos

Polihidroxi-alkánsav: termeltetés R. eutropha (Zeneca) Két fázisú fermentálás biomassza szaporítás P vagy S limitált növekedés és sok szénforrás mellett PHA termeltetés Kinyerés sejtfeltárás granulák elválasztása centrifugálás szűrés szerves oldószerrel extrakció spray drying

Polihidroxi-alkánsav: felhasználás Csomagolóanyag Flakon (Wella) Zacskó, tálca, folyadék Biológiailag lebomlik

Polihidroxi-alkánsav: felhasználás Prosztetikum, sebész cérna Kapszula, bioretard anyagok Lipáz, eszteráz bontja

Polihidroxi-alkánsav: felhasználás Prosztetikum, sebész cérna Kapszula, bioretard anyagok Lipáz, eszteráz bontja

Polihidroxi-alkánsav: lebontás Depolimeráz Hidrolizáló enzim Más észter kötést bontó Eszteráz Lipáz Celluláz Glükanáz Nem specifikus enzimek bioremediáció