Golgi komplex, fehérjék szortírozása és a vezikuláris transzport http://www.microscopyu.com/staticgallery/fluorescence/apm10.html Láng Orsolya Semmelweis Egyetem, Genetika, Sejt- és Immunbiológiai intézet FOK 2017 gsi.semmelweis.hu

Fehérjék sorsa összefoglalás

Fehérjék sorsa összefoglalás

A célbajuttató szignálszekvenciák jellemzői ismétlés A célbajuttató szignálszekvenciák jellemzői Cél organellum Helye a proteinen Szignál eltávolítás A szignál jellege dER N-terminal + 6-12 főként hidrofób aminosav, gyakran egy vagy több bázikus aminosav követi Mitochondrium 3-5 nem egymásutánni Arg vagy Lys reziduum, gyakran Ser és Thr; sohasem Glu vagy Asp Színtest Nincs általános motívuma, gyakran gazdag Ser,Thr-ban, kevés Glu és Asp Peroxisoma C-terminal - Ser-Lys-Leu Nucleus Internal 5 bázisos aminosav clustere vagy két rövidebb cluster melyet 10 aminosav választ el

Vázlat Golgi apparatus Fehérjék módosulásai Szekréciós mechanizmusok Vezikuláris transport elemei

Camillo Golgi (1843-1926) Nobel díj 1906 "internal reticular apparatus"

Golgi kimutatása I. Fénymikroszkóppal Fluorescens mikroszkóp Aoyama - ezüst impregnáció immuncitokémia Részleteket lásd a gyakorlaton

Elektronmikroszkóppal Ultravékony preparátum Fagyasztva törés

Golgi ultrastruktúrája zsákok (sacculus) csövek vezikulumok

cisz Golgi network (CGN) DER cisz Golgi network (CGN) anterográd cisz Golgi retrográd mediális Golgi transz Golgi transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

Elektron tomográfia

A Golgi és a sejtváz viszonya DNS Mikrotubulus hálózat Golgi

A Golgi elhelyezkedése Függ: - a sejt funkciójától-típusától (pancreas sejt apikális oldal) - polarizáltságától (migráló sejt- lamellopodium irányában) - sejtciklus fázisaival változik DNS Golgi Mikrotubulus hálózat

Fő funkciói válogatás transzformáció (átalakítás) membránba-csomagolás transzport válogatás transzformáció (átalakítás) membránba-csomagolás

Vezikuláris transport a cistrenák között Ciszternális érés cisz Golgi network (CGN) cisz Golgi mediális Golgi transz Golgi transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

Újra több adat támasztja alá a ciszternális sodródás jelenségét https://www.researchgate.net/figure/23148015_fig11_Figure-12-3D-models-face-on-views-of-a-trans-most-Golgi-an-early-TGN-and-a-late-TGN

cisz Golgi network (CGN) DER cisz Golgi network (CGN) Mannóz foszforiláció anterográd Mannóz eltávolítás cisz Golgi retrográd Mannóz eltávolítás mediális Golgi GlcNAc hozzáadása Galaktóz hozzáadás transz Golgi Sziálsav hozzáadása szortírozás Transz Golgi Network (TGN) Sejtmembrán

CGN a peptidek az ER-ből vezikulumokban érkeznek az érkező peptidek N-glikoziláltak nem történt válogatásuk az ER-ben A proteinek kétirányú transzportja: az ER szolubilis, endogén proteinjei transzport vezikulumokban recirkulálnak - retenciós szignál szükséges (KDEL) lizoszómális enzimek válogatása és transzportja

A lizoszómális enzimek válogatódása és modifikációja Mannóz-6-foszfát (M-6-P) szignál: a lizoszómális hidrolázok felismerésén alapul az ú.n. “signal patches” (szignál foltok – az aminosavak megfelelő 3D kombinációja) megkívánt fő enzime: GlcNAc-foszfotranszferáz Mannózok foszforilációja: elősegíti ezen enzimek osztályozását/válogatását további módosítástól véd

Az M-6-P jelölés

N- és O-glikoziláció

Glikoziláció a Golgi-ban Az N-glikozilációs mintázat módosítása cisz-Golgi: mannóz - típusú oligoszaccharidok komplex oligoszaccharidok TGN: sziálsavval történő kapcsolás – negatívan töltött O-glikoziláció: főként a mediális- és a transz-Golgi-ban zajlik a Ser és Thr oldalláncai glikozilálódnak

cisz- Golgi mediális- Golgi mediális- Golgi mediális- Golgi TGN transz- Golgi © 2000 by Geoffrey M. Cooper

Glikoziláció jelentősége Hajtogatódás – 3D konformáció proteázokkal szembeni védelem hidrofil karakter sejt adhézió (CAM-ok) antigenitás (A,B,O vércsoport antigének) transzport szignál (lizoszómális enzimek-M6P) external coat (glikokalix)

Egyéb módosulások glükóz-amino-glikán (GAG) láncok szulfatálás (proteoglikánok, peptidek Tyr rez.-ai) - TGN proteolítikus módosítás – szekréciós vezikulum

Proteoglikánok: nagyméretű, negatívan töltött, O-glikozilált és szulfatált fehérjék

Lipidek szintézise- módosítása a Golgi-ban ceramid glikolipidek szfingomyelin EC

Specifikus Golgi kimutatás MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Sejtek) epitél sejtek DNA (Hoechst) Golgi (ceramide) Lysosomes (LysoTracker) Molecular Probes, Inc.

compartmentjeinek enzim tartalma A Golgi különböző compartmentjeinek enzim tartalma acid phosphatase trans Golgi network osmium reduction cis-Golgi Savas foszfatáz TGN Ozmium redukció Cisz Golgi festetlen

Transzport utak a TGN-ből transz Golgi Lizo-szóma TGN szekréció Érés, módosítás exocitózis Konstitútív IC Regulált Sejtmembrán EC inzulin

A TGN-ből induló fő transzport útvonalak 1, endoszomális-lizoszomális compartment transzport vezikulumok - M-6-P receptorok 2, felszíni membrán - szekréció konstitutív szekréció – a felszíni membrán és az ECM lipid és peptid komponenseinek transzportja 3, exocitózis regulált szekréció

A szekréciós vezikulumok módosulásai szelektív aggregáció - TGN további modifikáció és válogatás inaktív előanyagok - aktív enzim vagy hormon (pl. preproinzulin (DER)- proinzulin (Golgi)- inzulin) koncentrálás - vízvesztés hidratálás – pl. proteoglikánok egyes citoplazmatikus anyagok felvétele pl. hisztamin

Konstitutív szekréció Pl: szérum fehérjék (máj sejtek) ECM fehérjéi, membránfehérjék Regulált szekréció Pl: hormonok, emésztő enzimek

A szállított molekulák koncentrálása membrán leválás révén Figure 13-65a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Az exocitózis fő lépései Figure 13-66a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A szekréció utolsó lépése az exocitózis (inzulin)

Alternatív útvonalak egyes molekulák, melyek nem a rER-en szintetizálódnak (pl. interleukin 1a és 1b - IL1a-IL1b, bázikus fibroblaszt növekedési faktor-bFGF) ezeket az ú.n. ABC-transzporterek szállítják (ATP-binding casette) az alternatív útvonal egyéb szerepe: - mérgező proteinek eltávolítása - a citoszól protein koncentrációjának szabályozása

Alternatív szekréció - fehérjék Pl. IL-1 beta (pro-inflammatórikus citokin) Pro-IL-1beta inflammaszoma Molekulári interakció indukálja a felszabadulást a megfelelő szignál következtében

Alternatív - vezikula Klasszikus szekréció Pl. alpha-synuclein szekréciója Klasszikus szekréció 2) Recirkuláló korai endoszóma 3) Exoszoma (multivezikuláris test (MVB)) http://www.nature.com/cddis/journal/v3/n7/fig_tab/cddis201294f2.html http://www.nature.com/cddis/journal/v3/n7/fig_tab/cddis201294f2.html

Különböző szekréciós mechanizmusok előfordulhatnak egy adott sejttípusnál is (pl. IL-1β) A gyulladásos szignál erősségétől függő mechanizmusok. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359610111000475

Hibák a válogató mechanizmusban lizoszómális enzimek nem kerülnek bele az endoszómába DE az enzimek belekerülnek a constitutív szekréciós útvonalba és kiürülnek I (=inclusion) = zárványsejt betegség: - GlcNAc-fozfotranszferáz defektusa - az enzimeken nincs M-6-P szignál - a lizoszómális enzimek “kiszabadulnak” a sejtből - a sejten belüli emésztés károsodik - a nem-emésztett anyagok ZÁRVÁNY-TESTEKET alkotnak

Vezikuláris transport

James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof 2013 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2013/med_image_press_eng.pdf

https://www. nobelprize https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2013/med_image_press_eng.pdf

Intracelluláris vezikuláris transzport Kommunikáció – sejten belül; sejt-környezet Belső membránrendszer Anyagok felvétele és emésztés helyére (lizoszómák) szállítása - endocitózis Proteinek szállítása az ER-Golgi útvonalon a felszíni membránhoz - exocitózis

Vezikuláris transzport fő útvonalai a sejtben Endocitózis Szekréció MVB= multivezikuláris test http://physrev.physiology.org/content/92/1/237

Intracelluláris vezikuláris transzport Endoplazmás reticulum A kétirányú, kompartmentek közti transzport egyensúlyban van Ezt a membránproteinek folyamatos visszaáramlása biztosítja A bioszintetikus-szekréciós és az endocitotikus útvonalak 10 vagy több kompartment között teremtenek kapcsolatot Golgi Késői endoszóma Szekréciós vezikulum Bioszintetikus-szekréciós útvonal Lizoszóma Endocitotikus útvonal Korai endoszóma Helyreállító-fenntartó útvonalak Extracelluláris tér

Transzport vezikulum A membránnal határolt vezikulumok meghatározott anyagokat szállítanak Szekréció Lizoszómális enzimek Membrán és ECM összetevői A szállítás irányát a membrán összetevői határozzák meg ld. donor és target compartmentek

Vezikuláris transzport molekuláris alapjai I. Fehérjék kiválogatása a donor sejtalkotóban szignál (a fehérjén) receptor (a donor membrán belső felszínén) 2. Vezikulum képződés és lefűződése szignál a receptoron burok a citoplazmatikus felszínen speciális foszfolipid összetétel mechanoenzim 3. A vezikulum szállítása diffúzió, citoszkeleton 4. Célmembrán megtalálása komplemeter v és tSNARE-k a vezikulumok citoszol felöli felszínén

Vezikuláris transzport molekuláris alapjai II. 5. A vezikulumok kihorgonyzása és dokkolása a célmembránon monomer G fehérjék (Rab) és SNARE-ek közreműködésével 6. A vezikulum és a célmembrán fúziója SNARE-ek és fúziós fehérjék 7. SNARE-ek szétválasztása NSF segítségével

Burkos vezikulumok A burok szerepe: Egyes membrán-komponenseket (pl. receptorok) meghatározott membrán-foltokba (patch) koncentrál A burokkal fedett felszín lefűződésének elősegítése – vezikulum képzés

Burkos vezikulumok típusai Clathrin-burkos vezikulum COPI-burkos vezikulum COPII-burkos vezikulum Mindegyik típusra eltérő transzport jellemző

A három burkos vezikulum morfológiailag is megkülönböztethető

Clathrin-burkos vezikulum: Golgi – plazmamembrán transzportok COPI- és COPII-burkos vezikulumok: dER - Golgi közti transzportok

Klatrin szerkezete és a klatrin burkos vezikulum

A clathrin-burok kialakulásában résztvevő protein-protein és protein-lipid kapcsolatok

Összefoglalás: Clathrin-burkos vesiculum AP: Adaptor protein Beta- arrestin Klatrin Dynamin

Vezikuláris transzport: dER - Golgi

Anterográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (1) Aktiválódás Szállítandó molekula bekötődése Sar1 – monomer G-fehérje

Előre haladó transzport – COPII (2) dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (2) Burok összeszerelése –vezikulum kialakulása Figure 13-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (3) Vezikulum lefűződése Heterotetramer Heterodimer Figure 13-13d Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Összefoglalás: COPII-burkos vezikulum

Retrográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Golgi- dER: Retrográd transzport – COPI Feltétel: retenciós szignál (KDEL) KDEL receptor COPI COPI triád: Arf1 - pink; gamma-COP - light green; beta-COP, dark green; zeta-COP - yellow; delta-COP - orange; betaprime-COP - light blue; alpha-COP - dark blue Figure 13-24a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Összefoglalás: COPI-burkos vezikulum ARF1

Vezikuláris transzort: A citoplazma egyéb részei

A vezikulum célba juttatás fő lépései SNARE – soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor v – vezikula t - target Transz-SNARE komplex Figure 13-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A célbajuttató rendszer regenerálása NSF – N-ethylmaleimide sensitive factor Adaptor fehérjékkel köt a membránhoz és széttekeri a SNARE-ket Figure 13-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A vezikulumok fúziójának lépései hemifúzió csőképződés fúzió Figure 13-17 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Homotipikus fúzió NSF – N-ethylmaleimide sensitive factor Adaptor fehérjékkel köt a membránhoz és széttekeri a SNARE-ket Figure 13-22 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A transzport egyéb fontos elemei: G proteinek pl. Rab fehérjék Foszfoinozitidek Fúziót meghatározó egyéb fehérjék pl. adaptorok Lefűződést elősegítő molekulák Folytatás a jövő héten

Figure 13-72a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)