Enzimológia Amiláz enzimek Dr. Barta Zsolt Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

2 Keményítő Felhasználása  egyiptomiak ­ruhák keményítésére ­lenszálak szövésénél ­papirusz ragasztására  rómaiak ­kozmetikumokban ­haj porozására ­szószok sűrítésére  perzsák, indiaiak ­édességekhez (halva)  kínaiak ­papír felületi bevonására  ma ­sűrítő ­Ragasztó, keményítő, textilipar írezés... Starch

3 Keményítő Amilóz /  -amylose  lineáris   -1,4  10-30%  burgonya DP kukorica DP  redukáló és nem-redukáló vég  gyengén vízoldható, micellákat képez  helikális elrendeződés hajlamos visszaalakulni 2 molekula ütközik  részlegesen dehidratálódik, kinyúlik  hidrogén kötések  asszociálódik  pelyhes csapadék főleg az amilózra jellemző (öreg kenyér morzsásodása)  jóddal  kék szín Starch

4 Keményítő Amilopektin / amylopectin  elágazó  láncban  -1,4  elágazás csatlakozás  -1,6  70-90%  elágazás minden cukormolekulán  oldallánc: monomer  DP:akár > monomer egység  vízben oldódik, micellákat képez  jóddal  lila szín Starch

5 Keményítő Lebontása a növényekben  lépésről-lépésre monomerré   -1,4 a keményítő-foszforiláz által   -1,6 az  -1,6-glükozidáz által Starch  HPO 4 2- 

6 Keményítő Lebontása az emberi szervezetben  kristályosat nehezen  főzés  emészthetőség   rezisztens keményítő: bontás nélkül halad át a vékonybélen Starch

7 Amilázok Keményítőbontó enzimek  endo-enzim: ­αlfa-amiláz, elfolyósít ۰αlfa-1,4 kötést bont ۰rövidebb láncokat, dextrineket (6-7 monomer) termel, αlfa-határdextrin  exo-enzimek: ­β-amiláz ۰nem-redukáló végről ۰maltózt hasít le, határdextrinek maradnak (elágazó amilopektin miatt) ­γ-amiláz (emberi bélflórában), amiloglükozidáz/glükoamiláz (mikrobák termelik) ۰nem-redukáló végről ۰glükóz egységeket választ le (maltózt csak lassan bontja)  elágazásoknál α-1,6 kötéseket bont  megszünteti az elágazásokat ­növényekben: R-enzim, mikrobákban: pullulanáz, izoamiláz  transzferázok: α-1,4 glikozidkötés bontása után új glikozidkötést hoznak létre Amylases

8 Amilázok  -amiláz /  -amylase  növények (magok csírázása), állatok, gombák, baktériumok (különböző eredetű enzimek!)  endo-enzim  anomer konfigurációt megtartó („retaining”)  amilózból maltózt, maltotriózt szabadít fel  amilopektinből glükózt, maltózt, dextrineket (  -határdextrinek)  működéséhez Ca 2+ kell  emberi ­nyálban (emberében van, de pl. ló, kutya, macska nyálában nincs amiláz) ۰5 izoenzime ismert ۰élelem lebontása 1. lépés ۰kevés cukor, sok keményítő + nyál és rágás  édesebb ۰nyál  -amilázt a gyomorsav inaktiválja (S-tal együtt részben aktív marad) ۰pH opt. 5,6-6,9 ۰evolúció  több kódoló gén másolat nagyobb arányú keményítő fogyasztóknál pl. japánok (sok rizs) 14, pigmeusok (esőerdő vadászat) 6 ­hasnyálmirigyben termelődik Amylases

9 Amilázok  -amiláz /  -amylase  növények, gombák, baktériumok (Bacillus polymyxa) állatok nem termelik, csak az emésztőrendszer baktériumai  exo-enzim  a nem-redukáló végről  anomer konfigurációt átfordító („inverting”)  β konfigurációjú maltózt képez  stabilitáshoz, aktivitáshoz nem kell Ca 2+  gyümölcsök érésekor:  -amiláz bontás  cukrok  édes íz   magokban csírázáskor aktív  sörfőzés:  -amiláz  árpa csírázáskor maláta készítése Maltóz  glükóz dimer   -1,4 kötés a két glükóz között  maltáz enzim hidrolizálja glükózzá (egyensúlyi reakció) Amylases

Átfordító és megtartó mechanizmus keményítőbontó enzimeknél 10      

11 Amilázok  -amiláz – amiloglükozidáz v. glükoamiláz /  -amylase - amyloglucosidase  exo-enzim  amilóz és amilopektin nem-redukáló végéről  -1,4 kötés bontásával glükózt szabadít fel  és  terminális  -1,6 kötést is bont  Átfordító mechanizmusú  maltózt csak nagyon lassan bontja  pH opt. 3,0-4,0  mikrobák, elsősorban penészek termelik Aspergillus, Rhisopus  magasabb rendű élőlények bélflóraja (  -amiláz) Amylases

12 Amilázok Amylases

13 Amilázok Maltáz –  -glükozidáz / maltase  αlfa-1,4 (néha αlfa-1,6) glikozid kötések hidrolízise  nem-redukáló végről  maltózt és malto-oligoszachariodokat hidrolizál  termék: αlfa-glükóz  csírázó magvak, burgonya  élesztő, baktériumok, penészgombák  nyál, hasnyálmirigy, vér, bélnedv  emberben többféle αlfa-glükozidáz ­maltázok ­szukráz/invertáz (szacharóz) és izomaltáz (izomaltóz: αlfa-1,6) Amylases

14 Amilázok Elágazásbontó enzimek / debranching enzymes  elágazásoknál αlfa-1,6 kötéseket és  határdextrint bont  izoamiláz csak αlfa-1,6 kötéseket bont, αlfa-1,4-et nem  Pullulanáz (Aerobacter aerogenez termeli) ­pullulánt is bontja pullulán: Pullularia pullulans (ma helyesen: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba) tartalék tápanyaga, glükóz polimer, maltotrióz láncokból α-1,6 kötéssel épül fel (α-1,4 és α-1,6 kötés) (pullulán ehető, ízetlen; felhasználása: élelmiszeradalék, kapszula- alapanyag) ­I-es típus: α-1,6 kötéseket vág maltotriózt szabadít fel ­II-es típus: α-1,4 és 1,6 kötéseket is vág (α-amiláz-pullulanáz) maltózt és maltotriózt szabadít fel neopullulanáz: α-1,4 és α-1,6 kötések bontása után transzglikozilációval új α-1,4 és α-1,6 kötést hoz létre Amylases

15 Amilázok Aktivitásuk mérése Az  -amiláz aktivitás meghatározásának alapjai  a redukáló cukrok mennyiségének növekedése ­keményítő hasítása  dextrinek  kisebb egységek (maltotetraóz, maltotrióz, maltóz és glükóz) ­új cukor redukáló végek megjelenése ­pl. dinitro-szalicilsavas eljárás: 3,5-dinitro-szalicilsav oxidálja a glükóz aldehid csoportját  3-amino-5-nitro-szalicilsav keletkezik  sárgás szín, fotometriásan mérhető  a keményítő-jód komplex kék színének intenzitáscsökkenése ­amiláz  kezdetben hosszabb molekulájú dextrinek  jóddal lila szín ­keményítő teljes lebomlása  az elegy jóddal nem ad színreakciót  keményítő szuszpenzió viszkozitásának változása  mesterséges szubsztrát hidrolízise ­kromofór csoport felszabadulása ­fotometriásan mérhető Amylases

16 Amilázok felhasználása Ipari felhasználás / Industrial applications  sütőipar cukrok  élesztő C-forrása  CO 2 amiláz  a pékáruk térfogata , állaga javul  élelmiszeradalék: E 1100 sütőipari állományjavító, stabilizáló ­sertés hasnyálmirigyből ­penészgombák által termelt  textilipar: keményítő bevonat eltávolítása  -amilázzal (írtelenítés), bakteriális amilázok  papíripar  detergensek: bakteriális amilázok  gyógyászati, klinikai alkalmazások ­maltooligoszacharidokból  -amilázzal  tiszta, viszkózus oldat  csecsemők, idősek, betegek táplálása ­nyálmirigy és hasnyálmirigy eredetű rendellenességek indikátorai  sörgyártás: cukor- és alkohol-tartalom beállítása  gyümölcslevek: keményítő-tartalmú gyümölcsök (pl. éretlenül szedett alma)  takarmányok emészthetőségének javítására Industrial applications

17 Amilázok felhasználása Ipari felhasználás / Industrial applications  kukorica keményítő bontása ­keményítőszörp eá. (glükóz + dextrinek, DE kb. 40%; édesipar: cukorkák eá.) ­maltóz szirup eá.  -amilázzal ­glükóz eá.  -amilázzal, pullulanázzal, amiloglükozidázzal ­izocukor eá.  -amilázzal, amiloglükozidázzal, glükóz-izomerázzal ­HFCS eá. (fruktóz 55% ioncserével) Industrial applications

18 Amilázok felhasználása Glükóz előállítása (lsd. Mezőgazd. iparok)  kukorica keményítő kinyerése ­a kukoricaszemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát  állati takarmány/csíraolaj kinyerése ­a csírátlanított szemeket megőrlik ­a keményítőt elkülönítik, tisztítják  előhidrolízis, elfolyósítás ­ °C, 5 perc (gélesítés)  <1 DE ­30-40% sz.a. szuszpenzióhoz α-amiláz (B. licheniformis) (+ 20 ppm Ca 2+ ) ­85-95°C, pH 6,0, 1-2 óra  8-18 DE  elcukrosítás ­hígítás  10-20% ­amiloglükozidáz (A. niger) + pullulanáz (Bacillus)  további hidrolízis  glükóz ­60°C, pH 4,5, óra  95 DE ­szűrés  termék: 95-98% glükóz Industrial applications

19 Amilázok felhasználása Industrial applications

20 Amilázok felhasználása Izocukor élőállítása  kukorica keményítőből eá. glükózoldat tisztítása, töményítése (40% sz.a.)  a glükóz-oldatot immobilizált glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át (pH 7-8) intracelluláris E  nehéz kinyerni  immobilizálják ­az enzimet Bacillus coagulans baktérium fermentációjával állítják elő (Novozymes) ­xilóz alapú fermentáció (xilán tartalmú búzakorpán)  glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) indukciója ­egyensúlyi reakció  a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik elméletileg max. 50% fruktóz rövidebb reakcióidő  kevesebb melléktermék, de így csak 42% fruktóz  oldat tisztítása töményítése bepárlással kb. 64%-osra  glükóz és fruktóz kromatográfiás elválasztása  fruktóz bekeverése a 42%-osba  HFCS (high fructose corn syrup) ált 55% fruktóz Industrial applications

21 Amilázok felhasználása Izocukor  glükóz-fruktóz elegy vizes oldata  élelmiszeriparban édesítőszerként  nehezen kristályosodik  erős nedvszívó képességű  megakadályozza a készítmény vízvesztését  Mo.: Szabadegyháza, Hungrana Kft. Európa legnagyobb kukoricafeldolgozója (3.000 t/nap feldolgozási kapacitás) Európa legnagyobb izocukor-kvótája ( t/év) EU termelés 27%-a Industrial applications

22 Amilázok felhasználása Sütőipar  az élesztő erjeszti a cukrokat  alkohol és CO 2 keletkezik  a tészta megkel  az élesztő termel amilázokat, de hosszadalmas (hosszú idejű kelt tészták, savanyú kenyerek)  amiláz hozzáadás  a keményítőszemcséinek lebontása kismolekulájú dextrinekre  az élesztő tovább tudja bontani  gyors  csíráztatott árpa (maláta) vagy gombaeredetű α-amiláz  megnő a tészta térfogata, és javul a bélzet textúrája, rugalmassága + öregedés késleltetése  ! már csekély túladagolásuk ragadós, gumiszerű tésztát eredményez ­α-amiláz hatására keletkező elágazó DP maltodextrin miatt ­elágazásbontó enzim, pl. pullulanáz adagolása Industrial applications

23 Amilázok felhasználása Textilipar  a fonalat szövés előtt dextrinnel vagy keményítővel vonják be: írezés  a felületet simává teszik  növelik a szilárdságot  a kész textíliákból amilázzal eltávolítják: írtelenítés  szelektív eltávolítás, a rostok nem sérülnek ­előmosás ۰nedvesítés és a nem keményítő anyagok eltávolítása ­impregnálás az enzimoldattal ۰65-70 / 75-80°C ­keményítőhidrolízis (már az impregnálásnál is) ۰2-16 óra reakcióidő, pH 6-7 (az enzim optimumán), / °C ­utómosás: az enzim és a hidrolízistermékek eltávolítása ۰szintetikus detergens + NaOH, °C, sav hozzáadás a lúg semlegesítésére  hőtűrő bakteriális amiláz Industrial applications

24 Amilázok felhasználása Papíripar  primer rostok feldolgozásakor (fából kinyert cellulóz) ­felületi kezelésére vagy ragasztóanyagként alacsony viszkozitású, nagy molekula tömegű keményítő-származékokok, dextrin ­ennek előállítása:  -amilázzal  szekunder rostok felhasználásakor (hulladékpapír) ­amilázos kezeléssel a rostok felülete megtisztítható az előző feldolgozás során alkalmazott keményítő alapú segédanyagoktól  a rost–rost kapcsolat fokozódik  erősebb papírokat lehet előállítani  javulnak a nedvesedési tulajdonságok  a rostosítás gyorsul Industrial applications

25 Amilázok felhasználása Juice Industry ► Amylase AG XXL Glucoamylase ► Biocip Membrane Glucoamylase / Polygalacturonase / Cellulase Brewing Industry ► Attenuzyme Glucoamylase ► Ceremix Plus Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase ► Cerezyme Sorghum Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase Starch industry ► DextrozymePullulanase / Amyloglucosidase ► Liquozyme Alpha-amylase ► Maltogenase Maltogenic amylase ► Termamyl All except Termamyl Classic Alpha-amylase ► Liquozyme Alpha-amylase Baking industry ► Fungamyl Super MA Alpha-amylase / Xylanase ► Novamyl Maltogenic amylase Alcohol Industry ► Saczyme Glucoamylase ► SAN Extra Glucoamylase ► SAN Super 360L Glucoamylase / Alpha-amylase / Protease ► Spirizyme Glucoamylase ► Liquozyme Alpha-amylase ► Novozym Glucoamylase Textile industry ► Aquazym Alpha-amylase ► Novoprime D 659 Alpha-amylase Detergent industry ► Duramyl Alpha-amylase ► Stainzyme Alpha-amylase ► Termamyl Alpha-amylase Pet food industry ► Extruzyme Pro Alpha-amylase Industrial applications