Nagyfeloldású Mikroszkópia Dr. Szabó István 11. Optikai mikroszkóp TÁMOP C-12/1/KONV projekt „Ágazati felkészítés a hazai ELI projekttel összefüggő képzési és K+F feladatokra"

11. Optikai mikroszkóp Elmélet – Az optikai mikroszkóp leképezési módjai – Szuper-felbontású mikroszkópia – Lencse nélküli mikroszkópiás rendszerek Gyakorlat – Mikroszkópos képek feldolgozása Segédanyagok

Történeti fejlődés Négy évszázados történet Aktív fejlesztés napjainkban is Az egyik legszélesebb körben használt kutatási eszköz „Molecular Expressions Microscopy Primer: Museum of Microscopy”. [Online]. Elérhető:

Történeti fejlődés 1. Középkor: olvasó kövek, okullárok 1590 Janssesn kétlencsés mikroszkóp 9x 1674 Leeuwenhoek 270x objektív, sejtek 1833 Brown pollen – Brown mozgás (atomi ütközések hatása, Einstein 1905) 1876 Abbe diffrakciós elmélete 1886 Abbe – Zeiss diffrakció limitált mikroszkóp

Történeti fejlődés Lebedeff Interferrencia mikroszkóp 1932 Zernike fáziskontraszt mikroszkóp 1952 Normanski differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp (DIK) 1968 Gábor Dénes, holográfia 1983 Sedat & Agard 3D mikroszkópia „wide field”+deconvolúció Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp Az Abbe-határ áttörése: PALM, STED, SI

Leképezés - alapok Az azonos szögben induló sugarak a hátsó fókuszsíkban találkoznak. A tárgy egyes ponjaiból kiinduló sugarak töltik ki a hátsó appertúrát

Véges / Végtelen – konjugált leképezés Véges konjugált kép távolság: továbbító lencséket igényel, régebbi objektívek Végtelen konjugált kép távolság: egy csőlencsét igényel, modern objektívek

Megvilágítás Köhler megvilágítás – A fényforrás minden pontja egy párhuzamos nyalábot hoz létre a minta felületén – Egyenletes megvilágítás egyenetlen fényforrás esetén is Kritikus megvilágítás – A fényforrás leképeződik a minta felületére – Tökéletesen egyenletes fényforrás esetén használható

Objektív Alaptulajdonságok Nagyítás Numerikus Apertura Véges / Végtelen konjugált Fedőlemez vastagság / Ha van Immerziós folyadék munkatávolság

Színhiba korrekció

Látómező görbület Planáris objektív (komplex, de fotomikroszkópiához szükséges

Geometriai torzítás Sugár irányban változó torzítás Párna Hordó A torzítás származhat a szemlencsétől.

Hullám Optika Az apertúra diffrakciós képe a végtelenben, illetve a lencse által leképezve keletkezik: Korong: Bessel fv. Airy minta

Felbontás a hullám képből Numerikus apertúra :

Felbontási kritérium

Numerikus Apertúra Munkatávolság Immerziós folyadék NA kisebb, mint a legkisebb törésmutató a lencse és a tárgy közt! (sin<1)

3D felbontás Pontforrás diffrakció limitált képe (3D PSF = Point Spread Function) Fókuszmélység geometriai optika és diffrakció limitált

Kontrasztot rontó tényezők Ideális: Háttér nélkül Valódi: Szóródott háttéren Aberráció: A kontraszt ellensége Kromatikus Görbült fókuszsík Torzítás Szférikus aberráció Asztigmatizmus Kóma

Optikai átviteli függvény Felbontási határ Térbeli frekvencia: periódus/méter Interaktív animáció

Megvilágító apertúra szerepe A megvilágító apertúra növelése növeli a felbontást, de csökkenti a kontrasztot

OTF és PSF kapcsolata Interaktív animáció

3D OTF A NA csökkentése gyorsabban rontja a tengely irányú felbontást: 2D kép esetén ez nagyobb mélységélességet jelent!

Az optikai mikroszkóp leképezési módjai

A fény anyag kölcsönhatás leírása Fénysugár – Geometriai Optika – Törés – Visszaverődés Elektromágneses hullám – Hullám Optika – Interferencia – Diffrakció – Polarizáció Foton - Kvantált fény-anyag kölcsönhatás – Abszorpció – Szóródás – Fluoreszcencia Kvantum hullám - Kvantum Optika – Nem klasszikus fényforrások, összefonódás, zaj csökkentés – Lézer, fotonikus kristályok, közeli tér gerjesztések

Mikroszkópiás alkalmazások Törés, visszaverődés Elnyelődés: – fény indukált reakciók: lágyulás, aktiválás – Fény indukált melegedés: elnyelés, fotoakusztika – Fény indukált fény Szórás, diffrakció Sugárnyomás : Optikai csipesz Fázis eltolódás : interferencia Szín eltolódás : fluoreszcencia

Néhány mikroszkópiás rövidítés RövidítésAngol kifejtés SDMSpinning Disk Microscopy +Decon3D Deconvolution Microscopy LSCMLaser Scanning Confocal Microscopy CLEMCorrelated Light and Electron Microscopy FCCS, FCSFluorescence (Cross -) Correlation Spectroscopy SPIMSelective Plane Illumination Microscopy FRET/FLIMFluorescence Forster Resonance Energy Transfer/Life Time imaging 2P, (2PE,3P)Two-Photon/Multi-Photon Excitation Microscopy SIStructured Illumination Microscopy

Kontraszt létrehozásának módjai Világos terű mikroszkópia: A minta abszorpciója Fáziskontraszt mikroszkópia: Az optikai útkülönbség Sötét látótér: Csak a szórt fényt képezi le DIC (Differeciális Interferencia Kontraszt): A helyi optikai úthossz különbség Polarizáció (A polarizáció változását jeleníti meg: kettőstörő anyagokra

Fázis kontraszt mikroszkóp A mintán szóródott és a környezetében irányváltozás Nélkül áthaladó nyaláb közt hoz létre fázistolást, -

Sötét látótér Csak a szórt fényt engedi át: a kondenzer egy fénykúppal világítja meg a mintát, ami nem képeződik le szórás nélkül.

DIC Egymásra merőlegesen polarizált, eltolt nyalábokkal világítja meg a mintát, amelyeket a leképezés során visszafordít és visszatol. A lokális fáziskontrasztot képezi le az eltolás irányában. A kontraszt irányfüggő és kiemeli az éleket. Az egyik él világosabb, a másik sötétebb, így 3D jellegű a kép

DIC felépítése

Fluoreszcens mikroszkópia Nagy kontraszt Specifikus, több színű jelölés Élő sejtek vizsgálata Kvantitatív eredmények Érzékelőként is funkcionálhat [Ca], pH, … Fluoreszcencia: Gerjesztő fénytől eltérő, nagyobb hullámhosszú fény kibocsátása

Fluoreszcens spektrum

A gerjesztett molekula „Felmelegszik” megnő a rezgési energiája Fényt bocsájt ki Kémia reakcióba léphet (fotokémia) Átadhatja az energiáját nem destruktív módon (fotoszintézis) Triplet állapotba kerülhet (foszforeszcencia)

Fluoreszcencia és foszforeszcencia

Szinglet és triplet állapotok HOMO LUMO Spin átfordulás tiltott a momentum miatt. Hosszú élettartamú meta-tabil állapot Hund szabály: A triplet alacsonyabb energiájú

Időskálák

Sok száz fluoreszcens molekula Problémák: Bomlás a gerjesztés hatására Spektrum eltolódás „Kifagyás” a környezet hatására Telítődés Széles spektrum Mérgező

Quantum pöttyök Félvezető nanokristály Kis méret : kvantum bezárás Polimer védő bevonat Fotostabil Keskeny, stabil spekrum „Nagy” 5nm + burok Pislogás / Ki be kapcsolhat

Szűrők A gerjesztő és a fluoreszcens fény intezitásarány 10 6 lehet

Szuper-felbontású mikroszkópia

Felbontás javítás széles sugarú leképezésnél Abbe-határ elérésének feltétele – Homogén törésmutatójú közeg – Nagy jelerősség – Minimális háttér intezitás Jel/zaj arányt rontják a gyakorlatban: – Optikai aberráció – Fókuszon kívüli elmosódás Fókuszsorozat használata, a PSF segítségével utólagos dekonvolúció széles látótér mellett! – Kép kontraszt javul – Kis mértékű felbontás javulás

Felbontás javítás Konfokális pásztázó mikroszkópia CLSM esetén Fókuszált lézer nyaláb pásztázza a mintát Csak a fókuszsíkból érkező fény jut a detektorba (fotoelektron sokszorozó, lavinadióda) A felbontás javításához a fényáteresztő lyuk méretének jelentős csökkentése kell, ami drasztikusan lecsökkenti az átjutó fényintenzitást.

Kommerciális nanoskálás távoli tér optikai mikroszkópia felbontása

Elvi alapok Moiré effektus révén a nagyfrekvenciás minta és világitás moduláció komponensek interferrenciája alacsony frekvenciás információt eredményez, ami leképezhető. A fluoreszcencia kioltása egy másik Nyalábbal. A világító tartomány a Nemlinearitás miatt a diffrakciós Határ alatt marad. Nagy számú mérés átlagolásával a fluoreszcens molekulák helyének mérési pontosságát statisztikusan megnöveljük!

Módszerek leírása MódszerLeírás CLSMConfocal Laser Scanning Microscope A pásztázott térfogat csökkentése, strukturált megvilágítás STED CW-STED Simulated Emission Depletion Continious Wave STED A gerjesztő és kioltó lézernyalábok nemlineáris együttes hatása lecsökkenti a fluoreszcens folt méretét. 3D-SIM3D Structured Illumination Microscopy Interferrenciával létrehozott különböző térbeli frekvenciájú megvilágításokkal alul mintavételezett jelből matematikai rekonstrukció PALM/STORMSingle molecule localisation and composition Az egyes fluoreszcens molekulák helyének ismételt mérésével és átlagolásával javított felbontás érhető el.

Szuper feloldású fluoreszcens mikroszkópia

Lencse nélküli mikroszkópiás rendszerek

Holográfiai elvek Gábor Dénes az elektronmikroszkóp felbontásának növelésére A fázis és amplitudó információk együttes rögzítése analóg módon referencia nyalábbal létrehozott interferenciával Optikai elterjedése a koherens lézer fényforrások megjelenésével következett be A leképezéshez nincs szükség lencsére, mivel a hullámfrontot rögzítjük és rekonstruáljuk

Digitális holográfia A holografikus képet digitális képsorozatként rögzítjük, a tárgyat számításokkal rekonstruáljuk. 3D képalkotás lehetősége Utólagos fókusz választás Nagy felbontás esetén objektív lencsét használunk, a lencsehibák utólag korrigálhatóak. Digitális holográfia koherens és inkoherens megvilágítással is megvalósítható

Digitális Holográfiás Mikroszkópia Reflektív minta Átmenő világítás Koherens fényforrás Interferrométer CCD kamera Alapvető kérdés a CCD felbontása

Interferrometriás képalkotó módszerek Fáziskontraszt mikroszkópia Differenciál Interferencia kontraszt mikroszkópia Pásztázó interferometria – optikai profilométer Specle Holográfikus leképezés Inkoherens digitális lencse nélküli leképezés

Mikroszkópos képek feldolgozása Gyakorlati feladatok

Optikai mikroszkópiás vizsgálatok Ismerkedés az optikai mikroszkóppal Képalkotási módok alkalmazása Felvételek készítése Mikroszkópos felvételek feldolgozása Mérések mikroszkópiás képeken

Ellenőrző kérdések

1.Hogy történik a leképezés az optikai mikroszkópban? 2.Milyen lehetőségek vannak a kontraszt létrehozására? 3.Mi korlátozza a felbontóképességet? 4.Milyen paraméterek jellemzik az tárgylencsét? 5.Milyen leképezési hibák léphetnek fel? 6.Hogy befolyásolja a megvilágítás a felbontóképességet és a kontrasztot? 7.Milyen célból alakalmaznak fluoreszcens jelölő anyagokat? 8.Hogy lehetett elérni az Abbe-határt az optikai mikroszkópiában? 9.Mi a holográfia alapelve? 10.Hogy lehet atomi feloldást elérni optikai eszközökkel?

Segédanyagok

Kiegészítő olvasmányok A guide to super-resolution fluorescence microscopy –

Programok GWYDDION SPM kép megjelenítő és manipuláló program –

Nagyfeloldású Mikroszkópia Dr. Szabó István KÖSZÖNÖM A FIGYELMET ! TÁMOP C-12/1/KONV projekt „Ágazati felkészítés a hazai ELI projekttel összefüggő képzési és K+F feladatokra"