Immun affinitás kromatográfia ELISA

Az előadások a következő témára: "Immun affinitás kromatográfia ELISA"— Előadás másolata:

1 Immun affinitás kromatográfia ELISA
(A diasorozat sok animációt tartalmaz. A kinyomtatott ábrák egy része animációként megtekintve nyeri el az értelmét!) ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (1.) Immun affinitás kromatográfia ELISA

2 AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

3 ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN
oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék „affinity purified antibody”: a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják. rákötött antigének

4 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag
kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

5 hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás polimer gyöngy Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

6 IMMUNPRECIPITÁCIÓ egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata) A bakteriális protein A vagy protein G fehérje (lásd korábban a szuperantigéneknél) erősen kötődik az immunglobulinok Fc-régiójához.

7 KROMATIN IMMUNPRECIPITÁCIÓ (ChIP)
A DNS adott szakaszával kapcsolatba lépő molekulák (általában transzkripciós faktorok) azonosítása Jelátviteli útvonalak és a génaktiváció közötti kapcsolatok felderítése

8 ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay
ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz

9 felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

10 AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ ANTIGÉN MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

11 Szekunder ellenanyagok
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés A szekunder ellenanyagok használatával nincs szükség arra, hogy a lehetséges óriási számú antigén specifikus ellenanyagok mindegyikét bonyolult procedúra során jelzéssel lássuk el. Ha a primer ellenanyagok pl. egér eredetűek, akkor elég pl. egy patkány anti-egér ellenanyagot létrehozni, amit jelzéssel konjugáltak. Gyakran jelet is erősít a szekunder ellenanyag A jelzés lehet: enzim (színreakciót katalizál) fluoreszcens radioaktív izotóp (RIA) mikrogyöngy (színes) vagy kolloidális arany (színes) preparatív módszerekben paramágneses részecske/gyöngy Primer ellenanyag Antigén Felület

12 Enzim-antienzim rendszer
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Leggyakrabban mikroszkópos immunhisztokémiai „festéseknél” találkozni vele Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén

13 Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Avidin Biotin Complex Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Biotin = B7-vitamin / H-vitamin Avidin = tojásból izolált molekula, mely az eddig ismert legerősebb másodlagos kölcsönhatást kialakítva köti a biotint (Kd~10-15M) (Feltételezhetően antibakteriális tulajdonsága miatt található meg a tojásokban (elvonja a biotint a környezetből) Egyes Streptomyces baktériumfajok is termelnek avidint (streptavidin) mely a kolonizációban biztosít számukra előnyt a többi megtelepedni próbáló kompetitor baktériumfajjal szemben.) A biotin pici molekula, könnyen ráköthető különféle fehérjékre. Avidin (szabad) Biotinált ellenanyag Antigén

14 (MÓDSZERTAN) M.Wilchek, EA. Bayer et al. Biotin Különféle reaktív kémiai csoportokkal módosított biotin származékok szinte bármire kovalensen felköthetők

15 Lásd a következő példákat.
A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat.

16 KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása felesleges konjugátum kimosása citokin tartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása Szendvics: két antigén specifikus ellenanyag „réteg” közt helyezkedik el az antigén „réteg” avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

17 BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

18 TUMORDIAGNOSZTIKA A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

19 Pajzsmirigy daganatok:
Hólyagrák: Az urothel sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tireoglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alfa Fötoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja leggyakrabban máj-, petefészek- és hererákkal, preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembrionális Antigén (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. tireoglobulin: pajzsmirigyhormon szintézis alap molekulája (kolloid) NMP22: korai stádiumban kimutatható a hólyagrák – monoklonális ellenanyagot használó eljárás – követésre is alkalmas EGF – epidermális növekedési faktor Her-2/neu protein: EGF receptor homológ 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek emelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

20 HER-2/NEU RECEPTOR SZEREPE AZ EMLŐRÁKBAN ÉS A MONOKLONÁLIS HERCEPTIN TERÁPIA MECHANIZMUSA
Herceptin - Trastuzumab terápiás monoklonális ellenanyag HER2 receptor is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB) family. Ligandum? Vannak pár cikk ami azonosítani véli. (Nem az EGF) HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), also known as Neu, ErbB-2, CD340 or p185 (encoded by the ERBB2) Pontmutációk lehetnek a transzmembrán doménben – ligand nélkül is dimerizálhat – terápiás ellenanyg ezt is gátolhatja allosztérikusan (Pertuzumab)

21 EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI
Antigén specifikus ellenanyag kimutatása Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával pl. rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével Autoimmun ellenanyagok kimutatása felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása pl. HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

22 FERTŐZÉSEK DIAGNOSZTIKÁJA
Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak ILYEN ELVEN MŰKÖDIK: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt (és rehidratált) vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya friss fertőzésben szenved. Ekkor még csak IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és így nem nyújtanak védelmet a magzat számára: A magzat szabadon fertőződhet. látencia – sok vírus képes a szervezetben inaktív, az immunrendszer számára sem látható módon létezni az életciklusának bizonyos szakaszaiban toxoplazma fertőzöttség és megemelkedett fiú születésszám: Naturwissenschaften. 2007 Feb;94(2): Epub 2006 Sep 30.

23 AUTOIMMUNITÁS A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl.: SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb antitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). Anti-ENA antitestek számos szisztémás AIB-ben megfigyelhetők (ld. Ouchterlony-módszer). I típusú (autoimmun) diabétesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90%-ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirozin foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75%-ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek) ENA: extrahálható nukleáris antigén (egyszerű procedúrákkal viszonylag könnyen, tisztán megkapható antigének)

24 SZÉRUM ELLENANYAG IZOTÍPUSOK MEGHATÁROZÁSA
A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fertőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus (izotípusokra specifikus) ellenanyagokkal ez eldönthető. anti-IgM anti-IgG IgM IgG antigén Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

25 KOMPETITÍV ELISA A szendvics módszerhez hasonlóan oldott antigének kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. Olyan kisméretű antigének, haptének kimutatására is alkalmas, ami szendvics technikával nem volna lehetséges - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása Kis mennyiségű antigén kimutatásánál vagy kis méretű antigének, vagy haptének esetében is használják, pl. ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop – szendvics ELISÁban elhasználná ezeket az első „capture” ellenanyag.

26 ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba
(MÓDSZERTAN) ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: a felszín telítésével/blokkolással detergens alkalmazásával Hook effect során a szendvics ELISÁban a kompeptitív ELISA jelensége valósul meg. A vizsgált mintában levő nagy mennyiségű antigént nem sikerül teljesen eltávolítani, ezért ott marad szolubilis formában is. A detektor/jelölt ellenanyagok jelentős része ezekhez köt az elkapottak helyett. Gyengébb lesz a színreakció. Pl. kitben kapható egylépéses, mosást nem is használó teszteknél könnyen előfordulhat ilyen. Hook effektus - Főleg egylépéses, egyszerű szendvics módszereknél fordulhat elő. A túl nagy koncentráció hamis kisebb koncentráció értéket mutat. Oka: Nagy koncentrációknál a kikötődött antigén a szabadon maradóval kompetitál a jelölt ellenanyagokért. Alaposabb mosásokkal vagy a tesztelendő minta hígításával elkerülhető.

27 ELKÉSZÜLT ELISA LEMEZEK
Különféle szubsztátok más-más színűek lehetnek. Az enzimreakció leállítását az enzim denaturálásával érik el. Ez sok esetben egyszerű kénsav. A közeg pH változása hirtelen megvátoztathatja a szubsztrát színét is, de az intenzitás különbségek megmaradnak. (Az ábrán nem ezt a színváltozást látjuk, hanem 2 eltérő ELISA lemezt)

28 pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből
Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

29 hCG KIMUTATÁSA IMMUNKROMATOGRÁFIÁS TESZTCSÍKKAL
elölnézet oldalnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott rész (A jelzés szabad szemmel is látható!) üvegfilter „papír” abszorbciós lap, mintafelviteli rész Az „ellenanyaggal átitatottság” valószínűleg liofilizátumot jelent vizeletminta

30 a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv hCG csapda ellenanyag sáv A tesztcsíkook egy adott antigén koncentráció tartományra vannak belőve!!! Ennél a formánál a nagyon magas hCG koncentráció fals negativitást mutatna! : (hook effect – a sok szabad hCG ráköt a csapda sávra és az ellenanyaggal jelölt hCG már nem tud kikötni rá) jelölt ellenanyagok Analóg a szendvics ELISÁval hCG

31 Ugyanez kompetitív rendszerben
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG) Analóg a kompetitív ELISÁval

32 kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek)
Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása (pl. aflatoxin - aspergillus mycotoxin) kolloidális méretű nemesfém partiulumoknak speciális fényelnyelési, gerjesztési, fényszórási sajátságai lehetnek, aminek eredményeképp intenzív színjelenséget tapasztalni. (élénk színűnek látszanak) A jelenség a localized surface plasmon resonance (LSPR) –hoz tartozik. Aflatoxins are naturally occurring mycotoxins that are produced by many species of Aspergillus, a fungus, the most notable ones being Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Aflatoxins are toxic and among the most carcinogenic substances known.  After entering the body, aflatoxins may be metabolized by the liver to a reactive epoxide intermediate or hydroxylated to become the less harmful aflatoxin M1 „Fáraó átkának” egy racionálisabb magyarázata Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

33 A KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA
Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl.: szín (abszorbancia, optikai denzitás) fluoreszcencia sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

34 Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad
A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.