Medium szelet-preparáláshoz (1 óra, 4 O C, frissen készítendő) 1. Gey’s Balanced Salt Solution 100ml 100% 2. Glucose 45% 1.1ml 5mg/m Szövet-szelet tenyésztő.

Az előadások a következő témára: "Medium szelet-preparáláshoz (1 óra, 4 O C, frissen készítendő) 1. Gey’s Balanced Salt Solution 100ml 100% 2. Glucose 45% 1.1ml 5mg/m Szövet-szelet tenyésztő."— Előadás másolata:

1 Medium szelet-preparáláshoz (1 óra, 4 O C, frissen készítendő) 1. Gey’s Balanced Salt Solution 100ml 100% 2. Glucose 45% 1.1ml 5mg/m Szövet-szelet tenyésztő médium (eltartható 1-2 hétig 37 O C, 5% CO 2 mellett; +4 o C-on 2-3 hétig) 1. Eagle Basal Medium Hanks 50ml 50% 2. Hanks’ Balanced Salt Solution 25m 25% 3. Horse Serum (heat inactivated) 25ml 25% 4. Glucose 45% 1.1ml 5mg/ml 5. L-glutamine 0.2M 500  l 1mM 6. Penicilline-streptomycin mixture 500  l 25  l/ml-25  l/ml Szövet-szelet tenyészetek 200-400  m vastag szeletek; Tápanyag-ellátás, átáramoltatás, gáz-ellátás Gähwiler et al., TINS 1997

2 Teljes (whole-mount) embrió „tenyésztés” 6 napos egér www.digs-bb.de Varga Balázs; MTA KOKI En2

3 fibroblasztneural stem Nem „halhatalan”, ún. primér szöveti sejtek : korlátozott ideig passzálhatók Valódi szöveti sajátságokat jobban őrzik, mint a halhatatlan sejtvonalak Sejttípusra jellemző sajátságok állandó ellenőrzése szükséges! „Halhatalan” sejtvonalak stabilabbak, de szöveti sajátságokat kevésbé őrzik Elsősorban általános sejtbiológiai kérdések vizsgálatára, gének kifejezésére, speciális sajátságú sejtek előállítására használhatók Megvásárolható „primér” sejttenyészetek: korlátozott számú passzázs;

4 Sejt-vonalak Végtelenségig osztódó, in vitro fenntartott, szövet-eredetű sejtek; „halhatatlan” sejtpopulációk Normál szöveti sejtek nem halhatatlanok; telomer-rövidülés (Hayflick L. 1965. Exp. Cell Res) DNS-javítás hibái „Ős”- stem (törzs)-sejtek : önmegújítás képessége végtelen? ES ; ( Evans,Kaufman 1981. Nature ; Thomson et al., 1998. Science ) EC ; (Martin, Evans 1974 Cell) Tumorosan transzformált sejtek : folytonos osztódásra képesek lehetnek HeLa, stb Génbevitellel immortalizált sejtek sejtciklust stimuláló virális gének (AV E1; SvTag; v-Myc), pl. HEK293, COS, stb sejtciklust szabályozó gének kiütése (p53, RBp stb kiütése) „őssejt-gének” (SOX2, c-Myc, Kfl-4, Oct4) bevitele : indukált pluripotens őssejtek (iPSC) Tumoros sejtekkel való sejtfúzió hibridóma vonalak (ellenanyag-termelő és myeloma B sejtek fúziója)

5 Idegi őssejt asztroglián

6 Sejtvonalak és sejt-klónok Klónozó gyűrűvel való izolálás Sorozatos higítás ½ x 1. 2. Sejtvonal : sokszoros passzázs után fenotípusosan azonos sejtek Sejt-klón : egyetlen sejtből származó populáció; pheno- és genotípusát tekintve is azonos sejtek Klónozás primér tenyészetből, sejtszuszpenzióból

7 Sejt-klónok fenntartása geno-, fenotípus megtartása folytonos osztódások alatt Változás okai: Sejt-kölcsönhatások → fenotipikus változások környezeti hatások → feno- és genotípus változások (!) „Túlnövés” → gyorsan növekvő, sűrű körülmények között életképes sejt-változat szelektálódik Gén-szintű változások : valószínűség ~ 10 -8 Ellenőrzés: Kromoszómaszám meghatározás Növekedési ráta Fenotípus jellegzetességei GFP-4C Recultured GFP-4C MTT

8 Sejt-felvétel Sejt-fagyasztás Kristályképződés: fagyásvédő additívumok fokozatos lehűtés Tárolás : folyékony N2 ! Átkritályosodás : gyors felolvasztás Fagyásvédő anyagok gyors eltávolítása Sejttípustól függő protokoll!!!

9 www.hpacultures.org.uk/collections/ecacc.jsp General Cell Collection Hybridoma Collection Primary Cells HLA-Typed Collection Human Random Control Collection Human Genetic Collection DNA Products General Cell Collection: C1300 CLONE NA Catalogue No.:93120817 Cell Line Name:C1300 CLONE NA Keywords:Mouse neuroblastoma Cell Line Description: CLONE NA is a subclone of Neuro-2a, a clonal line of C1300 mouse neuroblastoma cells. The cells were selected for spontaneous mutations deficient in HGPRT in the presence of 8-azaguanine. This cell line has been mycoplasma eradicated at ECACC. Species:Mouse Tissue:Neural Morphology:Neuronal-like Growth Mode:Adherent Subculture Routine:Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4x10,000 cells/cm² using 0.25% trypsin/EDTA; 5% CO2; 37°C. Cultures may not form a complete monolayer before subculture is required. Culture Medium:RPMI 1640 + 2mM Glutamine + 10% Foetal Bovine Serum (FBS).

10 www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines/cell_line_index.php Cell line:PK-15Cell type:pig kidney DSMZ no.:ACC 640 Origin:derived by single-cell cloning of the parent cell line PK-2a in 1957, which was established in 1955 from the kidney of an adult pig; cells were shown to carry an endogenous C-type retrovirus and to be susceptible to various viruses, e.g. viruses causing Hog cholera, African swine fever, and foot and mouth disease References:Pirtle and Woods,, Am. J. Vet. Res. 29: 153-164 (1968), PubMed ID 4965860 Armstrong et al.,, J. Gen. Virol. 10: 195-198 (1971), PubMed ID 4324256 Todaro et al.,, Virology 58: 65-74 (1974), PubMed ID 4132403496586043242564132403 Depositor:Dr. C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig, Germany www.lgcstandards-atcc.org/ ATCC® Number: CRL-2925™ Price: £378.00; €518.00 Designations: NE-4C Depositors: E Madarasz Biosafety Level:1 Shipped: frozenBiosafety Level: Medium & Serum: See Propagation Growth Properties:adherent Organism:Mus musculus (mouse) Morphology:neuroepithelialSee Propagation Source:Organ: brain Tissue: neuroectodermal Cell type: neural stem cell Strain: C57Bl/Sv129 Permits/Forms:In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits.MTAATCC and/or regulatory permits Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.click here Antigen Expression:Sox-2, Otx-2, En-1