Oligonukleotid szintézis

Az előadások a következő témára: "Oligonukleotid szintézis"— Előadás másolata:

1 Oligonukleotid szintézis
Mintegy 50 éves múlt 5 különböző kémia: foszfáttriészter, fosztittriészter, foszfátdiészter Foszforamidit, H-foszfonát Szilárd fázisú szintézis: hordozó: controlled pore glass (CPG), vagy polisztirol Mind DNS mind RNS szintetizálható mind a két módszerrel

2 Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer
B B 1 1 O H hordozó B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % Ac 2 O O H hordozó B 1 B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O O di-MeO Tr O O I 2 / H 2 O B di-MeO Tr O 1 B O 1 O O O O O P O O N C P O O O N C O O hordozó hordozó

3 Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER
Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni, vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula  Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon

4 OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE I.
- Deblokkolás: védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - liofilezés, sómentesítés

5 OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE II.
- méret szerinti elválasztás, PAGE, vagy HPLC (sokszor nem szükséges) Ioncserés kromatográfia Hidrofób kromatográfia a DMT csoporton keresztül - kvantitálás bázis e(µmol * cm/cm3) dA 15.4 dG 11.7 dC 7.5 dT 8.8 átlagosan e = 10 (µmol * cm)/cm3

6 OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK
- primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - antiszensz oligonukleotidok, génterápia - gén darabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

7 Polimeráz láncreakció I.
Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

8 Polimeráz láncreakció II.

9 A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI
 klónozás, megfelelő DNS szakaszok kinyerése, esetenként degenerált primerekkel  DNS szekvenálás, pl. ThermoSequenase  mutagenezis  szálspecifikus próbák előállítása  diagnosztika  fertőzések kimutatására  mutáns allélek kimutása

10 BELSŐ (NESTED) PCR 1. PCR 2. PCR 2 primer párt használunk  nagyobb specificitás, a nemspecifikus termékek eltűnése  költségesebb

11 INVERZ PCR A géneket környező régiók kiamplifikálkására
Általában a gén szekvenciája részben vagy teljesen ismert  primer pár tervezhető A hasítás 'A' restrikciós enzimmel önligálás PCR 'A'

12 REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT PCR
(RT-PCR) mRNS antiszensz primer reverz transzkripció reverz transzkriptázzal AMV: avian mieloblastosis virus RT MMLV: Moloney murine leukémia vírus RT Tth: Thermus thermophilus, Mn2+ jelenlétében cDNS szensz primer PCR Gének szerveződésének vizsgálatára 250 500 750 1000 RT+ RT- gK bp

13 REVERZ TRANSZKRIPCIÓ KAPCSOLT KVANTITATÍV PCR
Az RNS preparátumnak DNS mentesnek kell lennie exponenciális rész lineráris szakasz plató ciklus szám termék Hagyományos PCR-rel igen nehéz a termék mennyiségének a meghatározása

14 Real-time PCR T : SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI Denaturálás
Hibiridizáció DNA szintézis Real-time PCR : SYBRGreenI : fluorescens SYBRGreenI

15 Real-time PCR reakció analízise
Kalibráció ismert mennyiségű genomiális DNS-sel reprodukálhatóság ismeretlen mennyiségű templát cDNA-sel. 280ng 28ng 2.8ng 0.28ng 0.028ng gDNA:

16 A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.
- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket  speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

17 A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA
normális C gén mutáns 5' 3' A C 5' 3' PCR egészséges nincs termék beteg

18 GÉNSZINTÉZIS STRATÉGIÁK
1. Szintetikus DNS fragmentek összeállítása átfedő oligomerekből 1. fragment 2. fragment 1+2. fragment 3. fragment 1+2. fragment fragment hátrány: drága, mind a két szálat meg kell szintetizálni

19 2.a. Hajtű módszer 2. Fragment összeállítás primer-templát módszerrel
3’ 5’ 5’ 3’ Klenow, dNTP 5’ 3’ 3’ 5’ Több verzió is erre az enzimatikus feltöltési elvre alapszik. 2.a. Hajtű módszer 5’ 3’ Klenow, dNTP emésztés restrikciós endonuklázokkal ligálás

20 2. c. Fragment összeállítás a javító mechanizmus (gap repair) kihasználásával
Híd ligálás 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ átfedő szintetikus oligonukleotidok hasított vektor hibridizálás, enzimatikus feltöltés hasított vektor 5’ 3’ 3’ 5’ polimerizáció Klenow, dNTP ligálás közvetlen transzformálás transzformálás

21 Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal
sejtmembrán fehérjék mRNS sejtmag Kromoszómális DNS oligonukleotid citolplazma Cél molekula: fehérje mRNS DNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú a leolvasással ellentétes a leolvasással megegyezõ RNS DNS duplex triplex köcsönhatás fehérje-DNS RNS-DNS hibrid/ RNáz H Hoogsteen féle triplex Gátlás transzkripciós szabályozás transzláció transzkripció

22 Triplex képződésének kölcsönhatásai
homopurin homopirimidin szekvenciáknál

23 MUTAGENEZIS - in vivo gének elrontására,vagy módosítására
Random mutagenezis találomra létrehozott mutációk mutagén anyagok: UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb mutagén törzsek transzpozon mutagenezis Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

24 oriV: szűk gazdaspecificitás
Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 oriT ori Ar1 Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

25 oriV: szűk gazdaspecificitás
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT ori Ar1 vad típus mutáns poláris hatás ?

26 Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer alapján
pontmutációk! Dut: dUTPase Ung: uracil-N-glikoziláz Ne épüljön be dezoxiuracil A DNS-be in vitro szintézis, Klenow

27 QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

28 A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI: mutagenezis
random: a Taq polimeráz átírási hűsége rosszabb, hibák épülnek be és amplifikálódnak 1-2 hiba 1 kb hosszon Mn2+ vagy nukleotid analógok (inozin) növelik a mutációs rátát in vitro evolúció irányított: O1 Mf BamHI XhoI Mr O2 O1-Mr 1st PCR-s Mf –O2 O1 BamHI XhoI CO2 2nd PCR O1 – O2 XhoI BamHI digest with XhoI and BamHI ligate into XhoI – BamHI digested vector

29 FEHÉRJE TERMELTETÉS VAN GÉNÜNK: Legyen az prokarióta vagy eukarióta
természetes vagy szintetikus vad típusú vagy mutáns

30 FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK E. coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK emlős sejtvonalak minden fajta fehérje termeltethető bennük tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek, stabil expressziós rendszerek hosszú, fáradságos optimalizálást igényel élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, sok ismeretanyag viszonylag könnyű kezelhetőség poszttranszlációs modifikációk lehetősége

31 Escherichia coli ELŐNYÖK  óriási mennyiségű ismeretanyag
könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása ismert szelekciós rendszerek legtöbb expressziós rendszer HÁTRÁNYOK  általában nem szekretál a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidak kialakulása gátolt az eukariota poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding

32 STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE
KONSTITUTÍV PROMÓTER INDUKÁLT TERMELTETÉS a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig valamilyen indukcióval derepresszió további növesztés fehérje visszanyerése legáltalánosabban használt stratégia toxicitás sok esetben megoldható

33 PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
SZF TSZE GS Pr  SD kódoló szekvencia TT -35 -10 STOP kodon UAAU UGA UAG TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

34 A génexpresszió szabályozása
transzkripció transzláció DNS RNS FEHÉRJE transzkripciós szinten poszt-transzkcripciós szinten (mRNS degradáció, protein stabilitás, stb.)

35 Különböző faktorok relatív hatása a fehérje termeltetésre E. coli-ban
Promóter indukálhatóság kb x Gazdasejt kb x A mRNS 5’ struktúrája kb. 100 x Transzláció kb. 100 x növekedési sebesség kb. 50 x (mRNS stabilitás)

36 TRANSZKRIPCIÓ Iniciáció fehérje termeltetés során a legfontosabb
Elongáció mivel a gén belsejében van, nem manipulálható Termináció a transzkripció befejezése, a transzkripciós apparátus túlterhelésének elkerülésére

37 A transzkripció iniciációja prokariótákban
sigma faktor holoenzim ? /` NTD  CTD RNS polimeráz RNS polimeráz alegységek: , `, , ,  promóter 5’ 3’ 3’ 5’ k1 k-1 Ha k1 >> k-1, akkor a polimeráz holoenzim nagyon erősen kötődik a promóter szekvenciához, a polimeráz nehezen tudja elindítani a polimerizációs reakciót. Tehát a transzkript mennyisége csökken, habár in vitro a promóter és a holoenzim közötti kapcsolat erős. 5’ 3’ k2 k-2 5’ 3’ 3’ 5’ 5’

38 70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók

39 riporter fehérje aktivitás  Western blot fehérje detektálása
A génexpresszió tanulmányozása különböző módszerekkel különböző szinteken fehérje érése transzláció transzkripció Enzim aktivitás mérés mRNS detektálása Riportergén riporter fehérje aktivitás  promóter aktivitás Western blot fehérje detektálása A vizsgált operon promóter

40 nem specifikusan kötődik
ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I. más néven gél retardációs assay a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú! a DNS ne legyen től hosszú bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió történik lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció Natív poliakrilamid gél -: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve DNS jelölés DNS kötő fehérje nem kötődik kötődik összekeverés nem kötődik kötődik nem specifikusan kötődik

41 DNázI FOOT PRINT I. DNS hossz 100 – 200 bp
DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis Maxam-Gilbert létra DNázI hasítás DNázI * * G A+G C+T C D *

42 hiperszenzitív hely (HSH)
DNázI FOOT PRINT II. DNázI hasítás -: fehérje nélkül +: fehérje jelenlétében Maxam-Gilbert létra * * G A+G C+T C D- D+ hiperszenzitív hely (HSH) DNázI HSH * *

43 UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING)
Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem zavarja a kötődést) minta marker : Br MS? SDS-PAGE jelölt fehérje DNázI kezelés   EMSA UV fény kivágás, izolálás  a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz

44 A mRNS mennyiségének meghatározása
Northern-blot és hibridizáció reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel

45 Riporter gének alkalmazása
Regulátor régió riporter gén (pl. lacZ) Promóter SEJT -galaktozidáz (LacZ) -galaktozidáz aktivitás mérés feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma aktivitás mérés kiküszöbölése GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére

46 Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusa baktériumokban
operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátor policisztronos elrendezés regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor operon regulon

47 A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN
indukálószer represszor inaktív represszor derepresszált KATABOLIKUS aktív represszált BIOSZINTETIKUS indukált aktív aktivátor inaktív aktivátor RNS polimeráz negatív szabályozás pozitív szabályozás indukció represszió inaktív aktivátor inaktív aktív aktivátor indukálószer

48 FNR O2 - fumarát nitrát reduktáz regulátor
- citoplazmatikus szenzor-regulátor - dimer[4Fe-4S]2+ DNS-t köt - monomer[2Fe-2S]2+ inaktív - aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás - pO2 1 mbar alatt - TTGAT-N4-ATCAA konszenzus szekvencia - [2Fe-2S]  [4Fe-4S]2+ (in vitro) Cys, Fe, DTT, NifS - Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR Rhodobacter sphaeroides: FnrL O2 FNRred FNRox

49 Két komponensű szabályozó rendszerek
Komponensek - egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor - E. coli genom 2% - kb 50 különböző 2 komponensű rendszer - 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC

50 A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek működése elve
szenzor kináz fehérje DNS kötő fehérje Érzékelő Foszforilációs Felvevő DNS kötő szignál transzfoszforiláció DNS

51 ArcA/B O2 - aerobic respiratory control
- ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet (elektron transzport változást érzékel) - ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja  aktív - pO mbar között - TATTTaa konszenzus szekvencia - Haemophilus: ArcA - E. coli homológ gén: OmpR ArcA ArcB P O2 P ArcAP

52 A lac operon kettős szabályozása
laktóz (allolaktóz) indukál glükóz gátol, cAMP/CAP-n keresztül glükóz/egyéb cukor kiiktatása tápból nem célszerű  glükóz szabályozás kikapcsolása

53 lac (és trp) alapú promóterek
erősség “-35” “-10” trp AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA tac AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lacUV5 CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lac CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA lacUV5  lac promóter UV

54 A transzkripciós faktorok sokoldalúak….
Ara C Ara PBAD represszió +Ara PBAD indukció RNS polimeráz PBAD AraC

55 A transzkripció és a transzláció párhuzamosan megy baktériumokban

56 A triptofán operon szerkezete
protein antranilát szintáz indol-glicerin szintáz triptofán szintáz A triptofán operon szerkezete

57 Termináció – attenuáció – trp operon

58 mRNS degradáció baktériumokban
mRNS stabilitás prokariótákban néhány perc, eukariótákban órás nagyságrend előbb utóbb minden RNS lebomlik mRNS stabilitását meghatározó faktorok: - belső, saját szerkezet - a környezet hatására bekövetkezett változás a degradációs apparátusban puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei) Rhodobacter capsulatus degradációja O2 hatására felgyorsul policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása a mRNS régióinak eltérő stabilitásával

59 A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása

60 mRNS degradáció baktériumokban,
vizsgálati módszerek  - transzkripció gátlása (pl. rifampicin) t=0 időpontban, majd  időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..) a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója, hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása - in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal, a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig, majd analízis gélelektroforézissel, kvantitálás

61 mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők
5’ végi trifoszfát RNS struktúra riboszóma

62 A degradoszóma felépítése

63 A degradoszóma komponensei II.
PNPase (polynucleotide phosphorylase) 78 kDa alegységek, homotrimer 3'  5' foszfát függő processzív exonukleáz, ribonukleotid difoszfátok képződnek poliadenilációs aktivitás Polyphosphate Kinase (PPK) funkció: ATP regeneráció, polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás 80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli-ban

64 ATP hiányában a hurokstruktúra stabil marad
A degradoszóma komponensei III. Helikáz ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz 50 kDa RhlB a másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása ATP hiányában a hurokstruktúra stabil marad

65 Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő – enzimek
RNáz II 70 kDa monomer, a sejt 3'  5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a ribonukleotid monofoszfátok képződnek a PNPáz-zal együttes deléciója letális !!! PolyA polimerázok PAPI kDa PAPII kDa poliadeniláció, bázis hosszú mRNS instabilitás

66 A mRNS degradáció mechanizmusa

67 Transzláció prokariótákban

68 Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez, pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon) 10 x növekedés a termék mennyiségében a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja. Transzlációs start kodon kodon gyakoriság AUG 91 % GUG 8 % UUG 1 %

69 Az AUG előtti szekvenciák
20x-os különbség UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet) G-k kerülendők Az AUG utáni szekvenciák 30x -oskülönbségek lehetnek AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)... A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala) transzlációs szabályozás a 2. kodonnal +10 régió AT gazdag

70 Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetősen érzékeny, általban bázispár megengedett. - Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat. A köztes szekvencia összetétele “A” jó, ha van (2x-es stimulus), “C” mindegy “U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os gátlás) Upstream nemtranszlálódó szekvencia Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac). Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.

71 Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak, a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják az azonos aminosavakat kódoló tripleteket. Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént a gazda sejt preferenciájának megfelelően. Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása, ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével

72 Kodon felhasználási preferencia – táblázat
Sphingomonas paucimobilis AmAcid Codon Number / Fraction Gly GGG Gly GGA Gly GGT Gly GGC Glu GAG Glu GAA Asp GAT Asp GAC Val GTG Val GTA Val GTT Val GTC Ala GCG Ala GCA Ala GCT Ala GCC Arg AGG Arg AGA Ser AGT Ser AGC Lys AAG Lys AAA Asn AAT Asn AAC Met ATG Ile ATA Ile ATT Ile ATC Thr ACG Thr ACA Thr ACT Thr A CC Trp TGG End TGA Cys TGT Cys TGC End TAG 0.10 End TAA Tyr TAT Tyr TAC Leu TTG Leu TTA Phe TTT Phe TTC Ser TCG [gbbct]: 50 CDS's (13879 codons) egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban, vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.

73 STOP kodon STOP kodon UAA UGA UAG kötődő faktor RF1, RF2 RF1 RF2
Az esetek 80 %-ában: UAAU

74 PROTEOLÍZIS E. coli-ban
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa E. coli-ban Abnormális fehérjék, sejten belüli aggregátumok ATP függő endoproteázok polipeptidek < 1500 Da endoproteázok peptidek aminosavak oldékony mono-, di- és tripeptidázok

75 La (Lon) a fő ATP függő proteáz
87 kDa egységekből felépülő homotetramer, ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell, in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb. hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása) szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja, a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll: 32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

76 Proteolitikus ciklus inaktív proteáz (4 ADP) protein szubsztrát 4 ADP
4 PO43- 4 Mg 2+ 4 ATP - Mg2+ alloszterikus aktiválás aktív proteáz (4 ATP)

77 ATP hidrolízis mellett
Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer, ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű ATP és Mg2+ faktorok szükségesek hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól az alegységek külön multimerizálódnak HtpR szabályozás alatt áll Tulajdonság Ti (Clp) proteáz ClpP ClpA aktivitás fehérje degradáció ATP hidrolízis mellett peptidáz ATP független ATP-áz fehérje aktivált Kofaktor Mg2+ - Inhibítor MalNEt, iPr2P-F iPr2P-F MalNEt Stabilizálás ATP, glicerin hőstabil natív méret 700 kDa 260 kDa 160 kDa alegységek 6 ClpA + 12 ClpP 21 kDa 81 kDa

78 FÚZIÓS FEHÉRJÉK ELŐNYEI
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze, hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen. Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást követő régiókként helyezkednek el. ELŐNYEI 1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet 2. Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok 3. szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált) 4. Az in vitro hasítás sokszor pontosabb, intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez

79 Fúziós fehérjék oldhatósága
Oldhatatlan "iclusion bodies" trpEII, vagy cII, nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható, probléma: nem aktív fehérje pl sometostatin, inzulin A, B, ellenanyag termelés Oldható forma biológiailag aktív fehérje, affinitás oszlopon való tisztítás problémák a stabilitással, kevésbé jósolható

80 Egyéb hasznosítási lehetőségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később) a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet, diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás 2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható 3. funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra. 4. megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai vizsgálata

81 A fúziós fehérjék tisztításának elve
I. 1. affinitás kromatográfia II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia tiszta fehérje fúziós partner célfehérje

82 Fúziós partnerfehérjék
Fehérje Származási hely molekulasúly (kDa) szekréció ligand b-galaktozidáz Escherichia coli 116 - TPEG, APTG Protein A Staphylococcus aureus 31 + IgG Z szintetikus 7 CAT 24 klóramfenikol sztreptavidin Streptomyces 13 biotin PhoS 36 hidroxilapatit Protein G Streptococci 28 albumin MBP 40 keményítô GST 26 glutation poliarginin 1-3 ioncsere poliglutamát 1-2 polihisztidin 1-7 Ni2+, Zn2+, Cu2+ CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje; PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz; TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.

83 FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI.
ENZIMATIKUS Endopeptidázok ENZIM HASÍTÁSI HELY kollagenáz - Pro - Val  Gly - Pro - enterokináz - Asp - Asp - Asp - Lys  Xa faktor - Ile - Glu - Gly - Arg  trombin - Gly - Pro - Arg  tripszin - Arg, Lys  klosztripain - Arg  Ala64-szubtilizin - Gly - Ala - His - Arg 

84 A fehérje szekréció Előnyei Nómenklatúra:
szekréció: az extracelluláris térbe export: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe Előnyei A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan stabilabb termékek

85 Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban
Kotranszlációs transzport SRP, signal recognition particle, és receptora E. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY Poszttranszlációs transzport Sec útvonal: egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre Tat útvonal: több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is tartalmaz(hat)nak transzport: a fehérje összeszerelődése után

86 SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid COOH “N” “H” “C” 1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R fordulat P G hasítóhely A S -1 +1 X semleges vagy negatív fM V -3 Lipoprotein szignál peptid “C” COOH “N” “H” 1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R hasítóhely A G -1 +1 D lipoprotein kiválasztó szignál semleges vagy negatív fM L

87 A Sec útvonal

88 A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok összehasonlítása

89 + + Signal sequences for targeting Sec szignál peptid
erősen hidrofób + n-region h-region c-region SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le Twin-arginine szignál peptid moderáltan hidrofób + N S/T-R-R-x-F-L-K n-régió h-régió c-régió

90 A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise citoplazmatikus összeszerelődési modell
Holoenzim Periplazma csatorna Citoplazma szignál peptid prekurzor kofaktor(ok)

91 aktív formát felvett enzim
A TAT modell citoplazma TatC TatB TatA membrán aktív formát felvett enzim