1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete 2011. február.

Az előadások a következő témára: "1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete 2011. február."— Előadás másolata:

1 1. A steril laboratórium; 2. A tenyésztett sejtek folyadék-környezete 2011. február

2 „Glove box” a fülkében lévő anyag védelme a külső szennyeződéstől Biosafety Cabinets (BSCs) / biztonsági fokozat (BSL) az anyaggal dolgozók és a külső tér védelme a fülkében levő szennyezőktől (Class I) a fülkében levő anyag és a külső tér kombinált védelme (Class II) szűréssel a környezet fokozott védelme az „elhasznált” levegő zárt csőben való elvezetésével és a kikerülő anyag helyben sterilizálásával (Class III ; BSL-4 nagyon veszélyes anyagokkal végzett munkához) HEPA filter "High-Efficiency Particulate Air" Steril munka-fülkék Class III steril box

3 Termosztátok Mikroszkópok Hűteni is tud! Hőmérséklet-stabilizálás: víz-köpeny levegő-köpeny HEPA filter; 0,3  m Légtér-szűrésGáztér összetétel CO 2 / N 2 palackról; levegő páratartalom: víztartály ; buborékoltatás áramoltatás (ventillátor; speciális oldal/ajtó fűtés→konvekciós keverés Inverz optikai rendszerek az élő kultúrák monitorozására

4 Steril munkahely Sterilizálás – felületek: lemosás, steril légtér - eszközök: nagy-nyomású (1,2-1,3 bar) vízgőz (autokláv) száraz hő (Hő-lég sterilizátor; 180 – 240 C o gáz (pl. polietilén-glikol) gamma-besugárzás láng (égetés) alkohol - oldatok : nagy-nyomású (1,2-1,3 bar) vízgőz (120 o C) (autokláv) mikrohullám antibiotikumok, gombaölőszerek, citotoxikus vegyületek steril szűrés Steril környezet – helyiség: túlnyomás, külső levegővel való keveredés minimalizálása speciális takarítás, belépési feltételek - ruházat: szájmaszk, lábzsák stb Steril munkavégzés – kézfertőtlenítés, eszköz fertőtlenítés, lefedés, folyadék és hulladék kezelés Egyszerű asztali autoklávok

5 „Fiziológiás sóoldat” : 0,15 M NaCl = 300 mOsm = 150 mekv Na + + 150 mekv Cl - „Foszfát pufferelt fizsó” (phosphate buffered saline; PBS): pH stabilizálás, CO 2 /HCO 3 -, HEPES (10mM) Tyrode-oldat: glukóz CO 2 a levegőben: 0,039tf%

6 Ozmotikus viszonyok: telített vízgőz-atmoszféra kolloid-ozmotikus nyomás ozmometer Ion-összetétel (emlősök szöveti sejtjei!) Na+ / K+ : 150 / 5 mekv (mmol/l) Ca 2+ : 1,2-3,6 mmol/l anionok Puffer-kapacitás: CO 2 (!), HEPES pH ~ 6,8-7,3 Modern variációk: Earle, Hank, Eagle, Dulbecco sóoldatok: (szervetlen kiegészítők: Ca2+, Mn2+, Mg2+, Se, stb) minden medium „alapja” Tápanyag Glukóz (1000 g/l – 4500 g/l Aminosavak: esszenciális /nem-esszenciális koncentrátumok; „nutriens médiumok” (F-10,F-12), Piruvát, zsírsavak Hormon, vitamin kiegészítők Tápoldatok

7

8 Biológiai kiegészítők Szérum, szövetkivonat, kondicionált médium – ismeretlen összetételű bio-additívumok Heterogén, nem azonosítható bioaktív komponensek – növekedési faktorok, cytokinek, szteroid és peptid- hormonok, enzimek, adhéziós molekulák, stb Fötális, újszülött és felnőtt, illetve kb fajokból származó szérumok nem azonosak! Minden gyártmány-széria különböző lehet Sejttípus, sejtállapot- és sejtsűrűség függő igények: hormonok, vitaminok, cyto- és chemokinek, növekedési (mitogén és differenciációt okozó) faktorok „Definiált” médiumok: Szérum-mentes Fehérje-mentes Kémiailag definiált pl.: N2 médium : insulin ( 5  g/ml), transzferrin (100  g/ml), szelén ( 30 nM), progeszteron ( 20 nM), T3 ( 2) nM, Putreszcin (100  M) (Bottenstein, Sato 1979) „ Definiált” kiegészítők ITS, B27 (RA+/-), „Serum Replacement ”

9