Szövet-szelet tenyészetek

Az előadások a következő témára: "Szövet-szelet tenyészetek"— Előadás másolata:

1 Szövet-szelet tenyészetek
mm vastag szeletek; Membrán-felszín; Diffúziós átáramoltatás Medium for slice preparation (1 hour at 4OC, refrigerator, freshly composed) 1. Gey’s Balanced Salt Solution 100 ml % 2. Glucose 45% ml ~ 5mg/ml Regular medium for long-term culturing (at 37 OC –on 1-2 hétig stabil, 5% CO2 mellett. +4 Co-on való tárolás esetén is felhasználandó 2-3 héten belül) 1. Eagle Basal Medium (Hanks ml % (tf) 2. Hanks’ Balanced Salt Solutio ml % 3. Horse Serum (heat inactivated) ml % 4. Glucose 45% ml mg/ml 5. L-glutamine 0.2M l mM 6. Penicilline-streptomycin mixture 500l l/ml-25l/ml

2 Teljes (whole-mount) embrió „tenyésztés”
Whole embryo culture (WEC) ; New, D.A.T.; 1950’ - 50-100% frissen centrifugált patkány szérum mg/ml glukóz + O2 átáramoltatás; Folyamatos lassú rotáció Osumi, Inoue; METHODS 24, 35–42 (2001) doi: /meth , In vivo In vitro Yokoo T et al. PNAS 2005;102: 6 Napos (+12 órás) egér Hes5 expresszió; Varga B. Felvétele 2007

3 IVF : in vitro fertilization
Fragmentálódó blasztomérák megtermékenyítés 3 nap „kompact” embrió Korai blastocysta EB St 1 EB St 2 EB St 2-3 Tágult blastocysta EB St 4 2 nap Anyagcsere-igény jelentősen változik; optimális médium???? Lane, Gardner; Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology Vol. 21, No. 1, pp. 83e100, 2007

4 4,5 napos egér 6 nap in vitro

5 R1 embrionális törzssejtvonal sejtjeinek in vitro fejlődése
ES kolónia Embrioid csomó Gócza Elen felvételei Oct4, Aktin, DAPI 10 nap in vitro

6 aggregation ES cell chimera 3.5 days old chimera embryo
Chimaera-állatok ES sejtek beépítésével 1.GFB/B2 ES cell line aggregation ES cell chimera 3.5 days old chimera embryo chimera new-borns Gócza Elen munkája

7 fibroblaszt neural stem

8 Sejtvonalak és sejt-klónok
Sejtvonal : sokszoros passzázs után fenotípusosan azonos sejtek Sejt-klón : egyetlen sejtből származó populáció; pheno- és genotípusát tekintve is azonos sejtek 2. ½ x Klónozó gyűrűvel való izolálás 1. Klónozás primér tenyészetből, sejtszuszpenzióból ½ x Sorozatos higítás

9 Sejt-klónok fenntartása
geno-, fenotípus megtartása folytonos osztódások alatt Változás okai: Sejt-kölcsönhatások→ fenotipikus változások környezeti hatások → feno- és genotípus változások (!) „Túlnövés” → gyorsan növekvő, sűrű körülmények között életképes sejt-változat szelektálódik Gén-szintű változások : valószínűség ~ 10-8 GFP-4C Ellenőrzés: Kromoszómaszám meghatározás Növekedési ráta Fenotípus jellegzetességei Recultured GFP-4C MTT

10 ECACC – European Collection of Cell Cultures
General Cell Collection Hybridoma Collection Primary Cells HLA-Typed Collection Human Random Control Collection Human Genetic Collection DNA Products General Cell Collection: C1300 CLONE NA Catalogue No.: Cell Line Name:C1300 CLONE NA Keywords:Mouse neuroblastoma Cell Line Description: CLONE NA is a subclone of Neuro-2a, a clonal line of C1300 mouse neuroblastoma cells. The cells were selected for spontaneous mutations deficient in HGPRT in the presence of 8-azaguanine. This cell line has been mycoplasma eradicated at ECACC. Species:Mouse Tissue:Neural Morphology:Neuronal-like Growth Mode:Adherent Subculture Routine:Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4x10,000 cells/cm² using 0.25% trypsin/EDTA; 5% CO2; 37°C. Cultures may not form a complete monolayer before subculture is required. Culture Medium:RPMI mM Glutamine + 10% Foetal Bovine Serum (FBS).

11 ATCC – American Type Cell Collection
ATCC® Number: CRL-2925™    Price: £378.00; €518.00 Designations: NE-4C Depositors:  E Madarasz Biosafety Level:1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties:adherent Organism:Mus musculus (mouse) Morphology:neuroepithelial Source:Organ: brain Tissue: neuroectodermal Cell type: neural stem cell Strain: C57Bl/Sv129 Permits/Forms:In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location. Antigen Expression:Sox-2, Otx-2, En-1 Cell line:PK-15Cell type:pig kidney DSMZ no.:ACC 640 Origin:derived by single-cell cloning of the parent cell line PK-2a in 1957, which was established in 1955 from the kidney of an adult pig; cells were shown to carry an endogenous C-type retrovirus and to be susceptible to various viruses, e.g. viruses causing Hog cholera, African swine fever, and foot and mouth disease References:Pirtle and Woods, , Am. J. Vet. Res. 29: (1968), PubMed ID Armstrong et al., , J. Gen. Virol. 10: (1971), PubMed ID Todaro et al., , Virology 58: (1974), PubMed ID Depositor:Dr. C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig, Germany

12 Sejt-fagyasztás Sejt-felvétel