ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ

Az előadások a következő témára: "ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ"— Előadás másolata:

1 ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ
PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

2 Immunaffinitás kromatográfia
ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a szubsztrát hozzáadását követően ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az enzimreakció leállítását követően

3 AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

4 ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN
oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék „affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják rákötött antigének

5 A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása Kötődés Mosás
Elúció

6 ANTIGÉNTISZTÍTÁS Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció
oszlop Kötődés oszlop töltelék Mosás polimer gyöngy Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

7 IMMUNPRECIPITÁCIÓ egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata) A bakteriális A/G fehérje egy rekombináns fúziós fehérje, mely erősen kötődik az immunglobulinok Fc-régiójához.

8 ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay
ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz

9 felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

10 AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

11 Szekunder ellenanyagok
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Primer ellenanyag Antigén

12 Enzim-antienzim rendszer
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén

13 Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Avidin Biotin Complex Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin = B7-vitamin / H-vitamin Avidin = tojásból izolált molekula, mely az eddig ismert legerősebb másodlagos kölcsönhatást kialakítva köti a biotint (Feltételezhetően antibakteriális tulajdonsága miatt található meg a tojásokban. Egyes Streptomyces baktériumfajok is termelnek avidint (streptavidin) mely a kolonizációban biztosít számukra előnyt a többi megtelepedni próbáló baktériumfajjal szemben.) Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén

14 KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása felesleges konjugátum kimosása citokin tartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

15 EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI
Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

16 KOMPETITÍV ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

17 Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad
A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

18 BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

19 TUMORDIAGNOSZTIKA A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

20 immunoblot (Western blot) immunhisztokémia
AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK immunoblot (Western blot) immunhisztokémia

21 WESTERN BLOT Lépések: minta előkészítés (szöveti vagy sejtes)
gél elektroforézis blotolás jelölés előhívás Anode(+) Nitrocellulóz vagy Polyvinylidén Fluorid (PVDF) membrán Cathode(-) Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

22 WESTERN BLOT Western blot SDS-PAGE Membrán
Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Protein minta Standard Western blot SDS-PAGE Membrán

23 WESTERN BLOT Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

24 WESTERN BLOT Kimutatási eljárások:
Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria) Kemilumineszcens (ECL) Radioaktív (izotóp – RTG) Fluoreszcens (jelölés – CCD camera) 24

25 MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA /Enhanced chemiluminescence (ECL)/
H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer H2O detektálás Szekunder ellenanyag Membrán

26 IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA
Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) PE – fikoeritrin (narancssárga) Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz AP – alkalikus foszfatáz (a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) A grafikonokon a ellenanyaghoz konjugált FITC és az R-fikoeritrin (R-PE) emissziós spektruma látható. (Hullámhossz az x tengelyen, emitált fény intenzitás az y tengelyen. A zöld és sárga sáv a FITC és PE detektálásához általánosan használt fényszűrők hullámhossz szélességét szimbolizálja)

27 IMMUNHISZTOKÉMIA Festés előtti metszet FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta
FAGYASZTÁS

28 Sejtek (sejttenyészetek)
IMMUNHISZTOKÉMIA Enzim Biotin ABC komplex: biotinált ellenanyag avidin biotinált enzim Avidin Szekunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

29 Hagyományos hisztokémia
Hagyományos hisztokémiával csak kevés sejttípust tudunk azonosítani Hagyományos hisztokémia Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

30 (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
CD68 – különféle leírások szerint sokféle immunsejt expresszálja (B, T, DC, Granulociták, MF) Intracelluláris expresszió!!! szöveti metszetekben gyakran használják makrofág azonosításra CD68 is a glycoprotein which binds to low density lipoprotein. (de nem azonos az LDL-Receptorral) Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

31 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

32 Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC)
TRITC konjugált anti-aktin ellenanyagokal Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

33 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitokondrium F-aktin Sejtmag
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg. TO-PRO-3 jodid duplaszálú nukleinsav festék Quinolinium, 4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide falloidin – gombaméreg, ciklopeptid (duplagyűrűs heptapeptid) polimer aktint köt, aktin depolimerizációt gátol Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitokondrium F-aktin Sejtmag

34 Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt
Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endotél sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dilactate) Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszóma Mitokondrium Sejtmag