MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA

Az előadások a következő témára: "MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA"— Előadás másolata:

1 MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA
Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó

2 Követelmények II. éves vegyész BSc és III. éves vegyész „Műszeres analitika” tantárgyból Előadás: a „Tanulmányi és vizsgaszabályzat” szerint az előadásokon való részvétel nem kötelező, de ajánlott, hiszen a vizsgaanyaga döntően az előadások anyaga. Az első előadáson ismertetjük a féléves tematikát. Vizsgafeltétel: az „Az analitikai kémia” (kv1n1an1) előzetes teljesítése!!!! Vizsga: A hallgatók külön szóbeli vizsgát tesznek (egyazon vizsganapon) a „Spektroszkópia” és külön az „Elválasztástechnika” tananyagból, mely érdemjegyek átlagából kapják a végső jegyet. Valamelyik részvizsga elégtelenre való teljesítése esetén, a vizsgajegy elégtelennek számít. A sikertelen vizsga ismétlése a TVSZ előírásai szerint történik. Hármas, vagy annál jobb részvizsgát nem kell ismételni.

3 Irodalom Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai: Kémiai és műszeres elemzés, Semmelweis kiadó 1999, vagy ALLITER , Pokol György – Sztatisz Janisz: Analitikai kémia I fejezet Műegyetemi Kiadó, 1999 Dr. Mádi Istvánné: Elválasztástechnika (KLTE) Nemzeti tankönyvkiadó, 1993 Kremmer Tíbor, Torkos Kornél Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata Akadémiai Kiadó, 2010 Weboldalak

4 Weboldalak Animációk:
IONKROMATOGRÁFIA: AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA:

5 GÁZKROMATOGRÁFIA: HPLC: MS: MINTAELŐKÉSZÍTÉS

6 Elválasztástechnika KROMATOGRÁFIA:
Speciális fizikai-kémiai, analitikai és preparatív elválasztási módszerek összessége, oldatban levő, vagy gázhalmazállapotú, sokkomponensű elegyek összetevőinek egymástól való elkülönítésére. Általános alapelv: Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása.

7 Álló- és mozgófázis Állófázis: - szilárd,
- folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. Mozgófázis: - gáz  gázkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid kromatográfia A fázisok közötti anyagátmenet dinamikus jellegű. Minta „útja”: mozgó fázis  állófázis  új mozgó fázis új állófázis

8 Kromatogram kialakulása
. A csúcskiszélesedés úgy is interpretálható, hogy adott anyagnak az oszlop elején egyszerre induló molekulái nem egyszerre érnek az oszlop végére, tehát nem mindegyik halad az adott molekulafajtára jellemző átlagsebességgel. A sebességnek (és így a tartózkodási időnek) a diszperziója a csúcskiszélesedés másik értelmezése.

9 Csúcs elúciós profil Ki = ci,s ci,m
This displacement causes the concentration of solute in the mobile phase at the front of the peak to exceed the equilibrium concentration with respect to that in the stationary phase. As a consequence, a net quantity of solute in the front part of the peak is continually entering the stationary phase from the mobile phase in an attempt to re-establish equilibrium. At the rear of the peak, the reverse occurs. As the concentration profile moves forward, the concentration of solute in the stationary phase at the rear of the peak is now in excess of the equilibrium concentration.

10 Dinamikus egyensúly jön létre
Dinamikus egyensúly jön létre. Időegység alatt az állófázisba bejutott molekulák (atomok, ionok) száma = időegység alatt a mozgó-fázisba jutott részecskék száma (egy másik pontján a rendszernek). Speciális kölcsönhatások a minta és az állófázis között: a, Fizikai - adszorpció, - abszorpció (megoszlás). b, Kémiai - másodlagos kötőerők, - sav-bázis kölcsönhatások. c, Biológiai - enzim-szubsztrát kapcsolat

11 Adszorpció Egy gáz, folyadék vagy szilárd réteg képződése egy szilárd anyag, vagy ritkábban egy folyadék felszínén. A létrehozó erők természetétől függően két típusát különböztetik meg. A kemiszorpció egyetlen réteget képez a molekulákból, atomokból vagy ionokból, amelyek az adszorbeáló felülethez kémiai kötéssel kapcsolódnak. A fiziszorpció esetén az adszorbeált molekulákat gyengébb, van der Waals erővel kötődnek.

12 A kromatográfiás módszerek csoportosítása
KÖLCSÖNHATÁS AFFINITÁS MÉRTÉKE Adszorpciós kromatográfia Adszorpció Adszorpciós együttható Megoszlási kromatográfia Megoszlás (extrakció) Megoszlási állandó Ioncserés kromatográfia Elektrosztatikus (megoszlás) Töltés, disszociációs állandó, ionátmérő Gélkromatográ-fia Diffúzió Molekulaméret Affinitás kromatográfia Biospecifikus (adszorpció) Nincs általános mérték (Michaelis állandó)

13 ADSZORPCIÓS KROMATOGRÁFIA
Elválasztás alapja: Egy bizonyos fázisban oldott keverék egyes összetevői a másik fázis határfelületén koncentráció különbségeket mutatnak. Eltérő adszorpciós koefficiensek → koncentráció különbség a fázishatáron. Elrendezés: szilárd adszorbens  folyékony-, vagy gáz mozgófázis (oszlopban, síklapon) Az összetevők eltérő adszorpciója az adszorbens részecskék felületén → a komponensek a mozgófázissal fokozatosan távoznak, eluálódnak.

14 Adszorbeált anyag és adszorbens közötti kölcsönhatás
Koordinatív kötés Másodlagos kötőerők (diszperziós, dipól-dipól és H-híd) DE! Kemiszorpció- kovalens kötés kialakulása kerülendő

15 Adszorpciós egyensúly jellemzése az adszorpciós együtthatóval
KA ~ c állófázis c mozgófázis Izoterma telítési görbe Állófázison kialakul a monomolekuláris réteg→ c2 határértékhez közeledik Izoterma lineáris szakaszán lehet reprodukálhatóan mérni, ilyenkor az izoterma iránytangense a KA Ka függ az adszorbenstől, az eluenstől, hőmérséklettől. relatív borítottság: az elfoglalt aktív helyek számának és az összes aktív hely számának hányadosa adszorpciós izoterma: a relatív borítottság () az adszorbeálódó anyag parciális nyomásának függvényeként ábrázolva, állandó hőmérsékleten.

16 Adszorbensek jellemzése
Megfelelő szemcseméret. Szilárdság. Nagy felület (≥100 m2/g). Egyenletes pórusméret. Egyenletes szemcsealak, lehetőleg szabályos gömböcskék. Oldhatatlan legyen a mozgófázisban. Indifferens legyen a mozgófázissal és az elválasz-tandó vegyületekkel szemben.

17 Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége.
Adszorbens kapacitása: egységnyi tömeg által adszorbeált anyagmennyiség. Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége. Adszorbens szelektivitása: egységnyi adszorbenstömegen legnagyobb mértékben adszorbeált komponens mennyisége a többi összetevőhöz képest. Szervetlen adszorbensek: 1, Szilikagél – legáltalánosabban használt, Si-OH felületi csoportokkal, H-híd képzése az elválasztandó anyagokkal. Gyengén savas természetű – bázisos anyagok elválasztási nehézsége. pH=4-5 Kapacitás egyenesen arányos az adszorbens fajlagos felületével és a pórustérfogattal. Aktivitás az adszorbens kémiai sajátságaitól (oxid, oxid-hidrát, szerves polimer, stb.) és felületi sajátságaitól (szemcsenagyság, porozítás) függ.

18 O O O O

19 Kloroform adszorpciós izotermája szilikagélen, heptán oldószerben
The adsorption isotherm for chloroform adsorbed on a silica gel from a solution in n-heptane (13) is shown in figure 18. The variables given in the graph are not in the form of equation (29), but relate concentration of chloroform on the silica gel to the concentration of chloroform in the mobile phase. It is seen that the silica gel surface does not become completely covered with chloroform (and thus, have consistent interactive properties with respect to any solute) until the concentration of chloroform in the mobile phase is in excess of 40%w/w. Above a concentration of 40%v/v, the layer of chloroform covering the surface of the silica is almost complete and the properties of the interactive surface is no longer changing significantly with the mobile phase composition. Alkane mixtures with chlorinated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons and weakly polar solvents such as the alkyl ethers all appeared to give isotherms of the type shown in figure 18. Langmuir Adsorption Isotherm In gas/solid and liquid/solid chromatography the solutes are retained by building up one or more solute layers on the surface of the adsorbent. The original Langmuir adsorption isotherm was for single layer adsorption and gives a curve that describes the fraction of the surface area of the adsorbent covered with solute, as a function of the concentration of the solute in the contacting liquid phase. The Langmuir isotherm is a curve, convex to the solute concentration axis, and flattens out when the total surface is covered with solute. The isotherm for double layer adsorption is similar to single layer adsorption but the initial convex part of the curve is sharper. The adsorption isotherm only tends to linearity at very low concentrations of solute (at very low surface coverage) and so symmetrical peaks will only be achieved with very small samples. As chromatography detectors are very sensitive this does not become a problem as very small samples can be applied. 40 w/v%

20 Két-rétegű oldószer adszorpció – etil-acetát (B) heptánban (A)
The adsorption isotherms of the more polar solvents, ethyl acetate, isopropanol and  tetrahydrofuran from n-heptane solutions on silica gel were also determined experimentally by Scott and Kucera (12). They found that experimental results for the more polar solvents, did not fit the simple mono-layer adsorption equation. As a consequence, the possibility of bi-layer adsorption on the silica gel surface was examined. Bi-layer adsorption is not uncommon and the development of the bi-layer adsorption isotherm equation is a simple extension of the procedure used for the mono-layer equation. Consider the bi-layer adsorption of solvent (B), from a solution in solvent (A), on a silica gel surface, as depicted in figure 20. In a mixture of solvents (A) and (B), the interactive character of (B) is considered strongly polar, and that of solvent (A) strongly dispersive. For example, solvent (A) might be n-heptane and solvent (B) might be ethyl acetate.

21 Etil-acetát adszorpciós izotermája szilikagélen
It is seen that an excellent fit is obtained between the equation for the bi-layer Langmuir adsorption isotherm and the experimental data. It is also clear by comparison of the curve shape given in figure (21) with that given in figure (18) that a simple single layer adsorption function could not fit the experimental data. It is seen that the initial adsorption of the ethyl acetate on the silica surface to form the first layer increases very rapidly with the ethyl acetate concentration in the solvent.. The individual isotherms for the two adsorbed layers of ethyl acetate are included in figure (21). The two curves are of the same form but quite different in magnitude. The first layer is complete when the concentration of  ethyl acetate in the mobile phase is only about 1%w/w. As the concentration of ethyl acetate rises above 1%w/w the second layer is only just started forming. The second layer of ethyl acetate forms much slower and obviously the interactions between the solvent molecules with those already adsorbed on the surface are much weaker than their interaction with the silica gel silanol groups. Assuming the total area covered by the first layer of ethyl acetate will be very similar to the area covered by the second layer, only about one third of the layer is complete at an ethyl acetate concentration of about 4%w/v. This is in striking contrast to the formation of the first layer which is virtually complete at an ethyl acetate  concentration of 1%w/v. The interacting surface, with respect to interacting solutes, is now very complex indeed. In contrast to the weaker held solvents, retention will be modified dramatically as the concentration of the polar solvent increases from 0 to 1%w/v. Above 1%w/v, however, the retention of a solute will be reduced more subtly, allowing a more controlled adjustment of the chromatographic conditions. It should be pointed out that multi-layer adsorption is quite feasible. The second layer of ethyl acetate might have another absorbed layer of ethyl acetate on it. However, any multi solvent layers that may be formed must be progressively more weakly held  and sparse in nature. Under such circumstances their, presence, if in fact real, will have little impact on solute retention   in Heptane

22 Két-rétegű oldószer adszorpció + minta Heptán(A)+4m/V% etil-acetát(B)+benzil-acetát(solute)

23 2, Aluminium-oxid – bázisos jellegű
Felületi Al-OH- és Al-O- -hoz kapcsolódó H-híd képzése. Szerves adszorbensek: 1, Aktívszén Növényi és állati eredetű anyagok elszenesítési terméke (fa-, dióhéj-, csont-, vér- és cukorszén). Apoláros adszorbens → nagy móltömegű, szerves vegyületek kötődnek nagyobb mértékben (aromás-, kén-, bróm-, és jódtartalmú molekulák) diszperziós kölcsönhatások révén.

24 A mozgófázis jellemezése
A minta összetevőit eltérő mértékben oldja. A minta összetevőivel és az állófázissal ne alakuljon ki irreverzibilis kölcsönhatás. Viszkozitása csekély legyen. ELUOTRÓP SOROK A mozgófázis elúciós készségét jellemezzük az alkalmazott rendszer függvényében (adszorbens és adszorbeált anyag). Az elúciós készség a dielektromos állandóval (ε) arányos. Sorrend: a, aluminium-oxidon (hidrofil adszorbens): hexán<<benzol<kloroform<<etil-acetát<acetonitril<etanol <metanol<víz<ecetsav b, aktívszén (hidrofób): fordított sorrend Oldószerelegyek használata. Tisztaság! Kicsi elucios készség→startól nem viszi el, széles és lapos sávokat ad, melyek egymást átfedik Nagy eluáló képességű→mindent egyszerre eluálnak és az oldószerfrontban tömörítenek. Aluminium-oxidon hexánban oldva viszik fel a mintát → keskeny startzóna képződik, elució nagyobb oldószer erősséggel.

25 Kísérleti elrendezés Figure 2 shows the illustrations included in Tswett’s 1906 paper.6,10,11 His fairly simple laboratory setup consisted of 2–3 mm i.d. vertical columns, the upper parts of which were widened to serve as reservoirs for the solvent. The length of the packing was approximately 30–40 mm; a small cotton-wool wad was placed at the bottom to hold it in place. As many as five columns were connected to a manifold that comprised a horizontal glass tube connected to a larger vessel serving as a buffer volume. Using a small hand pump (a rubber bulb), he could exert a small pressure on the system. When separation was completed, the columns were removed, the adsorbent column — the packing with the separated multicoloured bands — was pushed out of the tube carefully with a wooden rod, and the individual bands were cut off with a scalpel. From these fractions, the adsorbed pure substances could be dissolved with a suitable solvent. If larger amounts were needed for additional investigations, columns of 10–30 mm i.d. with a packing length of 50–90 mm also were used. In such a situation, the separation process was performed under suction with a water-jet pump.

26 IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA
Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicse-rélni. Az ioncserélők általá-ban szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós cso-portjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex – anioncserélő).

27 Ioncserélők típusai Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós poli-merizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat. Szulfonálás, lsd előzö ábra

28 Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

29 Dextránalapú ioncserélők
DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino-etil). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok. Szilikagél alapú ioncserélők Módosított szilikagél, (3‹pH‹7). Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők. glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex O-CH2CH2NH+(C2H5)2 DEAE O-CH2COO-

30 Módosított szilikagél

31 4. Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!!
Az alumínium-oxidnak az izoelektromos pontján mind anion, mind kationcserélő kapacitása van. Izoelektromos pontnak nevezzük azt a pH értéket, ahol a felületen lévő negatív és pozitív töltések száma megegyezik. Ennek az értéke viszont a használt puffertől függ, például citrát pufferben pI=3,5 karbonát pufferben pI=9,2. A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

32 Gyantához kötött funkciós csoportok
KATEX típusú: Rgyanta-SO3H erősen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: Rgyanta-NR3OH erősen bázisos Rgyanta-NH3OH közepesen bázisos Rgyanta -SO3H szulfonsav Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

33 Kationioncsere: Rgyanta-SO3H + Na+  Rgyanta-SO3Na + H+ Az oldatban lévő Na+ ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H+ ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH3)3OH + Cl-  Rgyanta-N(CH3)3Cl + OH- Vagyis a gyantára kötött OH- ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

34 Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammó-nium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I). Ilyen típusú gyanták regenerálása nagy feleslegű bázist igényel , mivel ilyenkor OH-id formára kell hozni.

35 Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens pH értékének függvénye. Ilyen csopor-tok a primer, a szekunder és tercier aminok. Ábra szekunder amin csoport protonálódási folyamata Ábra A gyenge anioncserélő kapacitásának függése a mozgó fázis pH értékétől . A teljes ioncserélő kapacitás értéke akkor érhető el, ha a mozgó fázis pH értéke az amino csoport pKb értékénél legalább 2 egységgel kisebb. (I. szakasz).

36 Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis pH értékétől

37 Ionok kötödésének erőssége függ: Ionméret és fajlagos töltés.
Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye): puffer ion-koncentrációja, puffer pH-ja, alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril), ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást. puffer ion-koncentrációja nő – visszatartás csökkenEluenserősség Az előzőekből látható volt, hogy az eluenserősség egyrészt a mozgó fázisba tett puffer összetevő pH megszabta ionizáltságától függ, másrészt az ioncsere folyamatban a meghatározandó összetevő és puffer-ion verseng az ioncserélő helyen való kötődésért. Ha növeljük a puffer-ion koncentrációját ez csökkenti a minta összetevő megkötődési lehetőséget, így a visszatartását. Komplexképzésre való affinitás (hajlamosság) A mozgó fázis komplexképző sajátossága különösen fontos, ha több értékű fémionok elválasztását akarjuk megoldani. A többértékű fémionok erősen kötődnek a kation-cserélő felületén és ez nagy visszatartást eredményezne. Ezt csökkentjük az eluenshez adott komplexképzővel. Szerves oldószer hatása A visszatartás és a szelektivitás befolyásolására metanolt, etanolt, butanolt, glicerint és acetonitrilt kell adni a pufferhez. Ezek a szerves oldószerek adszorbeálódnak az álló fázis felületén. Mindazon ionok visszatartása és szelektivitása változni fog, amelyeknél a retenciót az álló fázis hidrofób részével történő kölcsönhatás befolyásolja. Például vízben oldódó szerves anionokét, ilyenek a formiát, acetát, propionát stb. Az ellenion minőségének és koncentrációjának hatása Az ioncsere egyensúlyi folyamat, amelyben a meghatározandó összetevő verseng a mozgó fázisban található ellenionnal ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

38 Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl
Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. , eluenserősség Ionizáltsági fok=eluenserősség Visszatartás alacsony pH-n nagy Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis pH értékétől

39 Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl
Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szerves bázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

40 DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK
Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkro-matográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb – 5 ug/L kimutatási határ. Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát. A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (post column reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

41 Két kolonnás ionkromatográfia

42 Gyanta-SO3-H+ + Na+ → Gyanta SO3- -Na+ + H+ H+ + HCO3- → H2CO3
Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserés oszloppal – két kolonnás módszer cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ion mérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában) lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO3, vagy Na2CO3: Gyanta-SO3-H+ + Na+ → Gyanta SO3- -Na+ + H+ H+ + HCO3- → H2CO3 H+ +  Cl-  → HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na+ → H2CO3). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl → HCl). Az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Az ionelnyomó kolonnán a mozgó fázis kationjai akkor is lecserélődtek, ha mérés nem történt. Ennek következtében a kolonna ioncserélő kapacitása kimerült, így az elemzést le kellett állítani, és a kolonnát regenerálni kellett.

43 Kationok elválasztása anioncserélő gyantaoszlopon (Varion AB)
Fémionok klorokomplexeinek elválasztása klorid-formájú anioncserélő oszlopon. Ni2+ klorokomplexe [NiCl]+ → oszlopon nem kötődik Co2+ [CoCl4]2- stabil-klorokomplex → oszlopon kötődik Klorid koncentráció növelésével eluálható az oszlopról. Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére. !!!! Vízlágyítás: Ca2+ és Mg2+ ionok Na+-ra cserélése. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

44 Automatikus aminosav analizátor
Erősen savas kationcserélő gyantán történik az amino-savak elválasztása. Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a pH-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony pH-n az aminosavak kationként viselkednek. A pH növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb pH-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

45 Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa-tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3-4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz-zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör-ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi-prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető. Az effluens és a ninhidrin-reagens keverékét az átfolyási sebesség által meghatározott ideig magas hőmérsékletnek teszik ki ( oC), így kialakul a szín, amelyet fotometrálnak.

46 Aminosavak reakciója ninhidrinnel

47 Ionkizárásos folyadékkromatográfia

48 Gyanta: nagy ioncserélő kapacitású kationcserélő.
Elválasztás alapja: alkoholok, szénhidrátok és szerves savak disszociálatlan formában be diffundálnak a pórusokba – hidrofób kölcsönhatás, H-híd a protonált ioncserélő csoportokkal. Mozgófázis: 0,01 – 0,001 M kénsav, vagy salétromsav, esetenként v/v% acetonitril.

49 GÉLKROMATOGRÁFIA Szinonim elnevezések:
gélszűrés, molekulaszűrés, méretkizárásos kromatog-ráfia, géláthatolási kroma-tográfia. Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak. Elsősorban biológiai mak-romolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkal-mazott technika. Fordított szűrő! Enzim, poliszacharid, nukleinsav, fehérje

50 Gélképző anyagok Természetes gélképző anyagok
Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint (CH2-CH-CH2-Cl) adnak. „Végtermék”: O Dextrán-O-CH2-CHOH-CH2-O-dextrán A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat. 1,2-,1,3-, 1,4-glükozid kötésekkel

51 Szintetikus gélképző anyagok
Akrilamid-akrilát kopolimerek: akrilamid és a N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimerizációjával állítják elő. A pórusméretet elsősorban az akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N’-metilén-bisz-akrilamid aránya határozza meg. Kereskedelmi forgalomban a Bio-Gel P típusok vannak. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatá-soknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek.

52

53 A GÉLKROMATOGRÁFIA ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
Makromolekulák sómenetesítése Puffercsere Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. Reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegű reagensek között. Frakcionálás Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása → gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasztása elsődleges. Polimerek móltömeg eloszlása Molekulatömeg meghatározás – ismert tömegű fehérje standard oldatokkal kalibráció. 1-3: csoport leválasztás, melynél a molekulák mérete közötti különbség igen nagy

54 Makromolekulák sómenetesítése
Vezetőképesség (μS) A legalább két peptidkötést tartalmazó vegyületek lúgos (alkalikus) közegben a kék Cu2+ ionokkal (ezeket tartalmazza a Biuret-reagens) ibolyaszínű rézkomplexet képeznek, amelynek nm-nél abszorpciós maximuma van. A komplex fényelnyelési maximuma eltér a Cu2+ ionok fényelnyelési maximumától, így a komplex 570 nm-en történő fotometriás meghatározásából következtethetünk a jelenlevő fehérje mennyiségére. NaCl mérése ezüst-nitráttal, illetve konduktometriásan. A 570 nm

55 V0 = szemcsék közötti térfogat Vi = pórustérfogat
teljes kizárási M mérési tömeg Lg M Lg M teljes áteresztési M Teljes kizárási és teljes áteresztési M jellemző egy adott gélre Vr= Vo+Vi V (ml)

56 Polimerek elválasztása

57 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA
Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. 20 éve alkalmazott technika. Koncentráló hatású. Nagyfokú szelektivitás jellemzi. Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására.

58 ALKALMAZÁSA Anyagok tisztítására (enzim, antitest) komplex biológiai elegyekből. Ugyanazon anyag natív formájának elválasztására a denaturált anyagtól. Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálása. Az ipari biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek gyártása.

59 Mátrix tulajdonságai:
Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Ligand tulajdonságai: Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében.

60 Mátrix fajták Agaróz D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose (lsd. gélkromatográfia)

61 Poliakrilamid (lsd. gélkromatográfia)
A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid poli-merek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. Hátránya: - mechanikailag kevésbé stabil; - erősen tapad az üvegfelületekhez. Szabályozott pórusú üveg Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokatalizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyamatokban. Üvegeket szilikonozni kell használat előtt.

62 Aktivált agarózhoz (brom-ciánnal aktiválunk, ekkor az agaróz C- OH-ja C= NH-ra cserélődik) hozzáadjuk a primer aminocsoportot tartalmazó kapcsolót (R-NH2) (nem lehet túl hosszú a visszahajlás és hidrofób kölcsönhatások miatt, ami nem specifikus adszorbcióhoz vezet. A kapcsolókar aminocsoportját átalakítják karboxillá (borostyánkősav-anhidrid), majd karboimiddel kapcsolják hozzá a ligand szabad amin csoportját peptidkötés létesítésével.

63 Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései:
1, A tisztítandó anyag megkötése. Kialakuló kölcsönhatások: - elektrosztatikus; - hidrofób; - hidrogénhídkötések. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 3, Elució – kölcsönhatások megszüntetése 1, Szelektív elució: biospecifikus elució, melyben az eluálószer a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás)

64 a, Elution of NADP dependent enzymes from Blue Sepharose by adding NADPH
"polyHis tags" on recombinant proteins: a sequence of His residues is placed (by genetic engineering of a cloned gene) at the C-terminus of a specific recombinant protein to be produced in vivo, and that protein can be purified on a column with Ni2+ ions (or Cu2+ or Co2+ or Zn2+) held in chelated form on an affinity column; the His imidazole groups on the end of the recombinant protein bind with high affinity, but other proteins don't stick. The recombinant protein can then be eluted with an imidazole buffer. b, Elution of HIS tagged proteins from HiTrap Chelating by adding imidazole.

65 2, Nem szelektív elució, sokszor denaturálódást jelent:
a, pH változtatása megvál-toztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken → deszorpció b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával → ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban).

66 Alkalmazás Fenil boronát affinitás kromatográfia - 1,2 és 1,3 cisz-diol csoportot tartalmazó cukrok kőtödnek hozzá – borsav-komplexek Lúgos közegben stabil – savval, szorbittal megbontható

67 Fetuin elválasztása Fetuin is a serum glycoprotein widely distributed
in mammals. Bovine fetuin contains up to 30% carbohydrate and has a molecular mass of 48 KDa. Also of note is its ability to promote cellular growth. It is therefore often used in cell culture and might be considered a common impurity in manufacturing processes where serum is employed to support cell growth. Fetuin is also regularly used as a model protein to represent the properties of glycoproteins,