Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek 7. hét Gyakorlat ELISA.

Az előadások a következő témára: "Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek 7. hét Gyakorlat ELISA."— Előadás másolata:

1 Elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek
7. hét Gyakorlat ELISA

2 pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből
Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

3 ELISA alaptípusok (ismétlő áttekintés)
capture/szendvics egyszerű Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag detektor/reporter ellenanyag Ag specifikus ellenanyag antigén Ag specifikus csapda ellenanyag antigén pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag kompetitív nincs jelen oldott Ag Ag specifikus ellenanyag antigén antigének kimutatásához, ha csak egyféle specifikus ellenanyagunk van, vagy Ag spec. ellenanyagok kimutatásához az egyszerű módszernél nagyobb érzékenységgel

4 Bioaktív anyagok kimutatása
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

5 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal
elölnézet oldalnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

6 a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok hCG

7 Ugyanez kompetitív rendszerben
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG)

8 kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek)
Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása kolloidális méretű nemesfém partiulumoknak speciális fényelnyelési, gerjesztési, fényszórási sajátságai lehetnek, aminek eredményeképp intenzív színjelenséget tapasztalni. A jelenség a localized surface plasmon resonance (LSPR) –hoz tartozik. Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

9 Vírusfertőzések diagnosztikája
Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak látencia – sok vírus képes a szervezetben inaktív, az immunrendszer számára sem látható módon létezni az életciklusának bizonyos szakaszaiban ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból, vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes, akkor ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

10 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek:
Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM ( =T-sejt vonal) sejtvonal antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, a felszínén HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget. p24 – kapszid fehérje burokfehérjék – gp120, gp41 (gp160)

11 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

12 Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

13 Tumordiagnosztika A tumor specifikus(TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a prostatic acid phosphatase (prosztatinsav foszfatáz?) (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

14 Pajzsmirigy daganatok:
Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyébb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben az embrionális fejlődés során van csak jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

15 izotípus specifikus ellenanyag
Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál) Az így kimutaott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető anti-IgM anti-IgG Memória válasz IgM IgG Antigén Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

16 Gyakorlati rész:

17 A koncentráció meghatározása
Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl: szín (abszorbancia, optikai denzitás) fluoreszcencia sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

18 Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad
A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

19 A két csőben azonos a koncentráció
Becslés „vonalzóval” Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml OD A két csőben azonos a koncentráció Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval azonos OD-hoz tartozó pontok Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… Felső és alsó lag fázis Egyenes egyenletébe, vagy alsó lag fázist felhasználva egy hígított minta alapján felszorozva hülyeséget számolni. Azonos 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai

20 standard koncentráció (µg/ml)
Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet OD Yminta=mx+b ystd=mx+b Felső és alsó lag fázis Egyenes egyenletébe, vagy alsó lag fázist felhasználva egy hígított minta alapján felszorozva hülyeséget számolni. Azonos 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai

21 Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! OD Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b Hígítási görbe Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül koncentráció

22 Bemutatás ELISA plate-ek IFNγ standard, és T sejt kultúrák felülúszójának hígítási soraival Melyik a töményebb minta? Próbáld meg kiszámolni a koncentrációt a kiosztott ELISA adatokból otthon! számolj a 3 párhuzamos adat átlagával használd a hígítás logaritmusát a hígítási görbe ábrázolásánál próbálj táblázatkezelő programot használni a feladat megoldásához (egy példa megoldását megtalálod az intézet honlapján a gyakorlatok között)